PAL è stato finanziato da un Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Questo lavoro è stato supportato da un MRC nuovo investigatore Research Grant (MR/L010933/1) e dal programma MRC concede MR/N026004/1 a PAL e da studentship BBSRC BB/M017222/1 a JET. Vi ringraziamo della coorte 2014-15 MPharm parte 1 studenti all'Università di Reading per aver preso parte nella prima iterazione di questo pratico e successive coorti per loro feedback e input.

Nota: Il protocollo qui sotto è stato sviluppato per essere tenuto nel corso di due ore (compreso il completamento di fogli di lavoro in classe) in un laboratorio didattico appositamente costruito. La procedura sperimentale sono stati deliberatamente messi insieme per escludere più dettagliata analisi della cinetica enzimatica (effettuato nel contesto di questo corso utilizzando i dati del modello); Tuttavia — come indicato nella discussione — il protocollo prevede un modello di analisi più avanzate, dipendendo dal livello di conseguimento di tempo, strutture e studente.
SICUREZZA: Questo pratico dovrebbe essere effettuato secondo le regole della buona chimica laboratorio pratica (GCLP) — dispositivi di protezione individuale, tra cui un camice da laboratorio fissato, guanti monouso e occhiali di sicurezza devono essere indossati tutte le volte in laboratorio .
1. Estrarre l'enzima
<ol><li>Schiacciare una compressa di lattasi, contenente 200 mg di enzima, una polvere anche utilizzando un mortaio e un pestello.</li>
	<li>Posizionare la polvere risultante in una provetta da 15 mL etichettati "sospensione" e risospendere in 10 mL di 100 mM tamponato fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Vortex per 1 min massimizzare l'estrazione degli enzimi.</li>
	<li>Trasferire 1 mL dalla sospensione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 1 min a 10.000 x g per particelle solide di sedimento.</li>
	<li>Trasferire 500 µ l del surnatante in una provetta pulita 1,5 mL etichettata "Estratto di lattasi".</li>
</ol>2. osservando la reazione colorimetrica
<ol><li>Posto 390 µ l di 100 mM PBS in una provetta da 1,5 mL etichettati "Quella A".</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione ONPG 5mm e mescolare bene su Vortex. Attenzione: Questo pratico utilizza orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside (ONPG) come un sostituto per il lattosio. ONPG, essendo un composto fenolico, esso deve essere maneggiato con cautela. In caso di contatto con la pelle con ONPG, lavare immediatamente la pelle esposta. Tutte le cadute devono essere pulite immediatamente con carta assorbente per essere smaltiti nel flusso dei rifiuti appropriato.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di estratto in quella A tubo e mix bene su Vortex.</li>
	<li>Osservare la miscela di reazione per 5 minuti e prendere nota di eventuali modifiche colorimetrici per la soluzione.</li>
</ol>3. misurazione dell'attività enzimatica
<ol><li>Impostare due provette da 1,5 mL: uno etichettati "Reazione B", uno etichettati "controllo".</li>
	<li>µ L 390 di 100mm PBS alla reazione tubo B, 400 µ l di 100 mM PBS per il tubo di controllo e quindi aggiungere 100 µ l di 5mm ONPG in ogni provetta.</li>
	<li>Mescolare il contenuto nel Vortex.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di Estratto di lattasi nella provetta di reazione B, mescolare nel vortex e lasciare che la reazione di procedere per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una volta trascorso 1 min, aggiungere 500 µ l di carbonato di sodio 1 M per entrambi i tubi per inibire l'enzima lattasi aumentando il pH, quindi terminare la reazione.</li>
	<li>Trasferire 500 µ l da ciascuna provetta in cuvette spettrofotometro pulito e misurare l'assorbanza a 420 nm utilizzando lo spettrofotometro.</li>
	<li>Nota la capacità di assorbimento per reazione B e campioni di controllo e quindi sottrarre il valore del controllo dal valore di reazione per derivare la variazione di assorbanza a causa di idrolisi di ONPG in presenza di enzima attivo.</li>
</ol>4. effetto della temperatura sull'attività dell'enzima
<ol><li>Impostare controllo tre tubi e tre provette di reazione, come descritto nella sezione 3 ed etichettare questi "4 ° C", "Temperatura ambiente" e "37 ° C".</li>
	<li>Dopo aggiunta di enzima estratto, incubare un tubo sul ghiaccio, uno a temperatura ambiente e uno a 37 ° C (in un bagno di acqua pre-riscaldata).</li>
	<li>Consentire le reazioni di procedere per 1 min e quindi terminare la reazione aggiungendo 500 µ l di carbonato di sodio 1 M in ogni provetta.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 420 nm per ogni tubo come descritto nella sezione 3. Registrare i valori, sottraendo il valore di controllo dal valore di reazione in ogni caso.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).</li>
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<li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li>
<li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li>
<li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Laboratory+Technology%22%5BJournal%5D)">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li>
<li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed063p242">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242(1986).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Una dettagliata conoscenza e comprensione degli enzimi, le reazioni enzimatiche e cinetica degli enzimi è necessaria per una vasta gamma di argomenti che abbracciano la biologia, la biomedicina e la farmacologia. Il protocollo descritto sopra utilizza lattasi come un esempio di un enzima rilevante per la salute umana per aver manifestato reazioni enzimatiche, fornendo competenze chiave che possono essere utilizzate in esperimenti di laboratorio più avanzati.
Questo protocollo è stato volutamente progettato per essere affidabile quanto possibili, permettendo agli studenti con poca o nessuna esperienza di laboratorio bagnato di produrre risultati interpretabili in un breve lasso di tempo. Nell'anno accademico 2014/2015 presso la facoltà di farmacia dell'Università di Reading, un totale di 144 studenti, organizzati in gruppi di 3, ha svolto l'esperimento "misurazione della lattasi", con tutti i gruppi in grado di rilevare un certo livello di attività enzimatica dal tablet di lattasi estratti.
Ci sono un numero di punti critici in questo protocollo. In primo luogo, è essenziale che l'estrazione iniziale è efficiente, consentendo di solubilizzazione di abbastanza enzima attivo per analisi successive. Nella nostra esperienza, primo anno gli studenti universitari possono farlo seguendo il protocollo come indicato; Tuttavia alcune indicazioni da manifestanti di laboratorio è stato richiesto a questo punto. Anche se sembrerebbe un punto evidente, un fattore chiave per il successo di questo protocollo è la capacità di misurare volumi, correttamente Etichettare provette e seguire attentamente le istruzioni. Mentre un certo livello di competenza può essere presupposto per molti studenti, attento monitoraggio e una chiara richiesta per gli studenti a chiedere assistenza nel caso in cui non sono sicuri di cosa fare successivamente fornisce la probabilità più grande di un test di successo.
Valutazione degli studenti può essere effettuata dalla classe foglio di lavoro (disponibile come materiale supplementare), chiedendo agli studenti di notare dati dagli esperimenti, commento sui loro risultati e link a informazioni/letture da materiale lezione, o da più dettagliata, dalla valutazione di classe con i dati del modello forniti consentendo analisi cinetiche essere tentato e valutati.
Il protocollo presentato qui è un semplice esempio di un analisi di attività della lattasi sotto condizioni di laboratorio di insegnamento, e c'è ampia possibilità di aumentare la complessità dell'esperimento per consentire analisi più avanzate. In particolare, il protocollo presentato viene fornita un'introduzione al concetto di cinetica enzimatica ma non consente l'analisi cinetica dei dati sperimentali. Come tale, vi consigliamo di visualizzare il protocollo descritto come un modello iniziale per le classi, con dettagli precisi adattati per soddisfare gli obiettivi specifici e talenti della coorte studente impresa gli esperimenti. Esempi di esperimenti estesi possono includere: ripetute misure a temperature diverse, utilizzando concentrazioni di substrato differenti per consentire analisi statistica, analisi cinetica dei dati (adatti per gli studenti di biochimica/Major), iniziando con diversi tablet differenti e consentendo agli studenti di valutare diverse attività dell'enzima in ciascuna (con l'aggiunta di control compresse, adatti per gli studenti/specializzandi di scienze forensi), valutando l'impatto della denaturazione al calore o svolgimento concorso esperimenti di aggiunta di lattosio o inibitori della lattasi (tabella 1). Un protocollo dettagliato per l'analisi cinetica di lattasi precedentemente è stato pubblicato12.
Un importante punto di forza di questo protocollo è che esso combina un'introduzione di base alla cinetica di enzimologia ed enzima con un caso di studio reale di enzimologia in medicina. Questo rende questo laboratorio esperimento di particolare rilevanza per gli studenti di medicina, farmacia, scienze biomediche e argomenti correlati. Soprattutto, il fatto che c'è una grave condizione medica e un più diffuso problema dietetico associato con catabolismo del lattosio offre l'opportunità di raccogliere una vasta gamma di questioni mediche ed etiche con gli studenti. Questo potrebbe includere le questioni che circondano la prova genetica per condizioni mediche e associate discussioni relative alla terapia genica e counselling genetico, così come uso e vendita di medicinali integratori. Uno dei principali limiti è che il protocollo non consentono una stima precisa della concentrazione di enzimi, a causa del materiale di partenza utilizzato per l'estrazione. Una modifica per tenere conto di questo, tuttavia, sarebbe quella di utilizzare degli enzimi di grado reagente per il dosaggio. D'importanza, questo permetterebbe anche per un calcolo più preciso della cinetica per l'enzima lattasi.
In conclusione, analizzando l'attività della lattasi in un laboratorio di insegnamento ambiente fornisce una robusta, coinvolgente e interessante introduzione al campo della biologia di enzima per fase iniziale gli studenti universitari.

Gli enzimi sono un tipo specializzato di proteine che agiscono come catalizzatori biologici per reazioni chimiche nel vivere organismi1. L'azione degli enzimi è fondamentale per la vita, fornendo energia, smaltimento dei rifiuti e permettendo di organismi a funzionare. Enzimi di comprensione è, quindi, fondamentale per una piena comprensione della vita. Tale conoscenza è essenziale per un'ampia varietà di programmi di laurea universitari, che vanno dalle scienze mediche alla biologia. Mentre uno sfondo dettagliato dai principi di catalisi ai modelli teorici dell'attività enzimatica può essere fornito agli studenti mediante lezioni e materiale di lettura, le proprietà delle reazioni enzimatiche sono meglio compreso da mani su esperienza pratica di gli enzimi in azione come precedentemente dimostrato2. Questo protocollo fornisce una semplice seguire il paradigma sperimentale per misurare l'attività dell'enzima in condizioni di laboratorio, utilizzando lattasi come esempio di un enzima con un'attività rilevante per la salute e la nutrizione umana.
La lattasi glicosidici idrolasi (EC 3.2.1.23/26) è un enzima di centrale importanza nutrizionale per mammiferi3. L'attività della lattasi è una proteina altamente conservata attraverso l'evoluzione e deriva dalla famiglia degli enzimi beta-galattosidasi — una famiglia presente da Escherichia coli attraverso a Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)4. L'importanza critica della lattasi in un ambiente nutrizionale umano deriva dal suo ruolo nel permettere la ripartizione di lattosio nei suoi componenti costitutivi monosaccaride, che possono quindi essere utilizzati per generare energia nel corpo. Lattasi catalizza l'idrolisi del legame glicosidico nel disaccaride lattosio, rilasciando galattosio e glucosio (Figura 2)5. Questi monosaccaridi vengono quindi utilizzati principalmente per la produzione di adenosina trifosfato (ATP) attraverso il ciclo dell'acido citrico e fosforilazione ossidativa6. Durante lo sviluppo infantile e neonato, lattasi è altamente espressa nell'apparato digerente umano, lattosio ricevuto dal latte materno che di cui lattosio è il componente primario del carboidrato e una delle principali fonti di nutrizione durante i primi anni 7. l'importanza medica di lattasi è evidenziata da deficit congenito di lattasi (CLD), uno stato recessivo autosomal raro causato dalle mutazioni nel gene della lattasi (LCT) che codifica per l' enzima lattasi8. Neonati con CLD esibiscono l'attività della lattasi molto poco, quindi non possono essere alimentati con il latte materno, qualsiasi altro tipo di latte, o una formula contenente lattosio.
Durante l'infanzia, l'espressione della lattasi è normalmente ridotta; Tuttavia, questa riduzione dopo lo svezzamento varia geograficamente, con circa il 35% di adulti in tutto il mondo continua ad esprimere l' enzima9. Sostenuta espressione della lattasi, nota come persistenza di lattasi, consente alle persone di continuare a digerire il latte e derivati da una gamma di fonti. Al contrario, la perdita di espressione di lattasi può comportare l'intolleranza al lattosio, noto anche come adulto-tipo hypolactasia (ATH), risultanti da un'incapacità di scomporre il lattosio nell'intestino. ATH è caratterizzata da una build up di lattosio nel colon dopo ingestione di lattosio contenenti prodotti alimentari. Nel colon, il lattosio accumulato viene fermentato da fauna microbica dell'intestino, rilasciando gas tra cui l'idrogeno, metano e anidride carbonica. Gonfiore addominale, flatulenza aumentata, dolore, nausea, borborigmi (brontolio di stomaco)7e promuovere la produzione di questi gas in individui con deficit di enzima lattasi. Aumento dei livelli di lattosio nell'apparato digerente può anche portare alla perdita di feci.
Il controllo dell'espressione genica LCT è modulato da polimorfismi localizzati in introni del gene MCM6 nelle vicinanze. Gli individui con sostenuta espressione della lattasi trasportano polimorfismi che fungono da rinforzatori distali forti per LCT espressione genica, compensando così la normale regolazione della trascrizione di LCT durante lo svezzamento e di conseguenza sostenere l'espressione della lattasi in età adulta3. Polimorfismi di Enhancer sono stati suggeriti per sono stati selezionati positivamente dopo l'addomesticamento dei bovini e dei cammelli in Medio Oriente oltre cinquemila anni fa9,10.
I sintomi che derivano da ATH possono essere gestiti riducendo l'assunzione di lattosio, ad esempio rimuovendo i latticini dalla dieta. Un approccio alternativo per ATH e l'approccio di scelta per CLD, è l'uso di integratori di lattasi, ampiamente disponibili in farmacia. Questi integratori forniscono lattasi isolata da una varietà di fonti, compresi i lieviti e batteri, in forma liquida o basati su pillola che può essere presa con o aggiunto al lattosio contenenti alimenti. Il supplemento sarà idrolizzare una percentuale del lattosio presente nel cibo ai prodotti glucosio e galattosio, così permettendo il loro assorbimento e accumulo di substrato di lattosio non digerito nell'intestino.
Basata sull'utilizzo di integratori di lattasi come aiuto dietetico, abbiamo sviluppato un esperimento di laboratorio di enzimologia semplice adatto per studenti primo anno biomedicali scienza o farmacia. Questo esperimento di laboratorio si avvale di integratori di lattasi commercialmente disponibili e usi orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside (ONPG) per fornire un punto di fine colorimetrico per la misurazione la scissione dei legami glicosidici di lattasi ( Figura 3)11. ONPG agisce un substrato artificiale per la lattasi, che quando sottoposto a idrolisi da questo enzima produce D-galattosio e orto-nitrofenolo. Quest'ultimo prodotto ha un colore giallo, assorbendo la luce ad una lunghezza d'onda di 420 nm. Di quantificare eventuali modifiche di assorbanza a seguito di 420 nm l'esposizione di ONPG per lattasi, è possibile valutare l'attività di questo enzima. Questo esperimento di laboratorio fornisce una dimostrazione dell'attività enzimatica idrolasi. Costruendo in ulteriori repliche e svolgimento di analisi in condizioni diverse, è possibile incorporare più sofisticate analisi di cinetica enzimatica, fornendo un prezioso esempio di vita reale degli enzimi in azioni rilevanti per la salute umana.

<table><tbody><tr><td>Lactase tablet</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (powdered)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pestle and mortar</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing scales</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Comprensione del funzionano di enzimi e concernenti questo esempi di vita reale, è fondamentale per una vasta gamma di corsi di laurea in scienze biologiche e biomediche. Questo facile da seguire protocollo è stato sviluppato per studenti del primo anno dello studente non laureato farmacia e fornisce un'introduzione entry-level di reazioni enzimatiche e procedure analitiche per l'analisi dell'enzima. L'enzima di scelta è la lattasi, come questo rappresenta un esempio di un enzima disponibile commercialmente rilevante per la pratica umana di malattia/farmaceutico. Lattasi è estratta da compresse integratore alimentare e valutata utilizzando un saggio colorimetrico basato su idrolisi di un substrato artificiale per la lattasi (orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside, ONPG). Rilascio di orto-nitrofenolo seguendo la scissione idrolitica di ONPG di lattasi è misurata da una variazione di assorbanza a 420 nm e l'effetto della temperatura sulla reazione enzimatica viene valutata effettuando la reazione sul ghiaccio, a temperatura ambiente e a 37 ° C. Analisi più avanzate può essere implementata usando questo protocollo valutando l'attività dell'enzima in condizioni diverse e utilizzando reagenti diversi.

Risultati rappresentativi per la sezione 2 del protocollo sono mostrati in Figura 4A. La reazione di controllo, in assenza dell'enzima lattasi, rimane chiara, mentre la soluzione di reazione, contenente Estratto da the tablet di lattasi, diventa gialla come ONPG è idrolizzato rilasciando orto- nitrofenolo. Figura 4B Mostra quantificazione usando unità arbitrarie da sezione 4 del protocollo, seguente l'analisi dei campioni utilizzando lo spettrofotometro. Produzione di orto-nitrofenolo è minima quando la reazione viene incubata sul ghiaccio e massima quando la reazione è condotta a 37 ° C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Figura 1 : Escherichia coli beta-galattosidasi. (A) struttura di cristallo di beta-galattosidasi da Escherichia coli, mostrando la struttura tetramerica del principio attivo complesso. (B) Allolactose (mostrato in rosso) associato al sito attivo della beta-galattosidasi. Immagini generate da PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Figura 2 : Azione enzimatica della lattasi. Idrolisi del lattosio di lattasi per la produzione di beta-D-glucosio e beta-D-galattosio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Figura 3 : Idrolisi di orto-nitrofenolo - beta -D-galattopiranoside. Idrolisi ONPG di lattasi per la produzione di beta-D-galattosio e orto-nitrofenolo (che è di colore giallo), che permette la stima dell'attività lattasica di misurazione dell'assorbanza a 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Figura 4 : Idrolisi ONPG. Risultati rappresentativi di idrolisi ONPG, mostrando controllo e le provette (A) e dati rappresentativi dal punto 4 del protocollo registrato su fogli di lavoro in classe, risultati grezzo assorbanza in unità arbitrarie a 420 nm, rettificato per sfondo e a tre diverse temperature (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Condizione sperimentale</td>
			<td>Variabili sperimentali</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione del substrato</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibizione competitiva</td>
			<td>lattosio ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM o 10 mM 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipendenza dal tempo</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione al calore</td>
			<td>Estratto di lattasi riscaldata a 100 ° C per 10 minuti prima del test</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: potenziale estesa condizione sperimentale. Ha suggerito gli esperimenti estesi, da effettuarsi in triplice copia, indagando su aspetti specifici della lattasi Biologia.

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Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

L'attività enzimatica della lattasi è essenziale per la lavorazione catabolica del disaccaride lattosio. Qui, l'attività della lattasi trovata negli integratori alimentari è analizzata utilizzando un saggio colorimetrico. Questo fornisce agli studenti una piattaforma sperimentale per comprendere l'attività della lattasi ed enzima cinetica.

Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Ricerca

Biochimica

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Ambiente

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Bioingegneria

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Enzyme Activity

<h4>Biological Catalysts</h4>

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require an input of energy to start, which is called the activation energy. Catalysts are chemicals that lower the activation energy. Even though catalysts facilitate a chemical reaction, they are not consumed by it. This means a catalyst can facilitate a specific chemical reaction over and over in succession, increasing the rate of that reaction.

Enzymes are biological catalysts that increase the speed and efficiency of biochemical reactions. Most enzymes are proteins but certain ribonucleic acid molecules also have catalytic properties. Each type of enzyme can only bind to one or a few specific substrates, therefore, there is a vast diversity of enzymes, all with distinct functions. The specific reaction of an enzyme depends on its active sites, which has shapes that closely matches the shape of its substrates. Upon substrate binding, the enzyme changes shape slightly in a way that allows the chemical reaction to happen more readily, thus reducing the activation energy of the reaction. Once the reaction takes place, the enzyme releases the products and returns to its original shape, which allows it to repeat the process again.

<h4>Catabolytic versus Anabolic Enzymes</h4>

Most enzymatic reactions can be categorized as either catabolic and anabolic, which have opposite functions. Enzymes that mediate catabolic reactions break down larger substances into multiple products. A well-known catabolic enzyme is lactase, which splits the disaccharide lactose in dairy products into monosaccharides galactose and glucose. Humans have large amounts of lactase in their small intestine after birth, however many individuals lose more than 90% of their lactase by early childhood1. This reduction diminishes the ability to digest lactose in an age-dependent manner, which is known as lactose intolerance2.

Anabolic enzymes combine multiple substances into a single product. For example, the enzyme DNA polymerase synthesizes DNA molecules by joining nucleotides together. Similarly, the enzyme glycogen synthase connects glucose molecules to generate glycogen. Insulin regulates the activity of glycogen synthase, therefore diabetic patients with low to no insulin levels cannot synthesize glycogen without insulin treatment3.

<h4>Environmental Factors</h4>

The shape and charge of the active site of an enzyme is tailored to the specific chemical reaction it catalyzes, therefore the enzyme activity is influenced by factors that affect its active site. Hence, enzymes require specific conditions to work at optimal levels and depending on their function and location, these conditions can vary greatly. These factors include pH and temperature. For example, active sites of enzymes often contain acidic or basic amino acids. Deviations from the optimum pH alter the charges in the active site, making it difficult for the substrates to interact with the enzyme. This property has been used for centuries to preserve food by pickling, which reduces the pH of the pickled food item to a level that effectively inhibits microbial enzymatic activity. Similarly, each enzyme works at an optimal temperature range. If the temperature shifts below or above this range, it alters the shape of the active site, preventing it from effectively interacting with its substrates. In most cases, returning to the optimal temperature restores the enzyme&#8217;s original shape and function, however, temperatures that are too high can denature or irreversibly damage the enzyme structure. Again, these properties are useful for food safety; we cook meat thoroughly to kill harmful bacteria by denaturing their enzymes and refrigerate most food items to slow down enzymatic activity of microorganisms.

Extremophiles, or organisms found in extreme conditions that are lethal to most forms of life, have enzymes capable of functioning at those extremes. For instance, Thermus aquaticus is a bacterium found in hot springs and hydrothermal vents reaching temperatures at which most proteins would denature. Taq polymerase is a thermostable DNA polymerase found in T. aquaticus, which has allowed the development of polymerase chain reaction (PCR), a widely-used laboratory method for rapid DNA replication. PCR requires high temperatures to separate the strands of the DNA double helix to be replicated. Taq polymerase remains stable at these high temperatures while most enzymes would be degraded. PCR cycles between high temperatures that break the DNA into single strands and lower temperatures that allow the polymerase to build new double stranded DNA.

<h4>Molecular Factors that Influence Enzyme Activity</h4>

In addition to specific pH and temperature ranges, some enzymes function better in the presence of other molecules or ions. Coenzymes are biomolecules that bind to the active site of the enzyme and participate in catalysis without getting consumed by the reaction. Coenzymes often transport electrons, specific atoms and functional groups, and thus act as intermediary carriers. B vitamins act as coenzymes for numerous biochemical reactions. For instance, coenzyme A (coA), which is the active form of pantothenic acid, is required by 4% of all mammalian enzymes4. Cofactors are often classified as inorganic substances, such as ions, that are required for the enzymatic function. For example, all DNA polymerase enzymes require Mg2+ or Mn2+ for DNA replication as well as excision of incorrectly incorporated nucleotides5.

There are also other molecules that are not necessary for an enzyme to function but are capable of altering the enzymatic activity. Substances that increase the enzyme activity are called activators, whereas others that decrease the enzyme activity are called inhibitors. These molecules bind to enzymes either at the active site or other locations on the enzyme known as allosteric sites. Sometimes these molecules can bind to the exact location in the active site as the substrate, and thus compete with the substrate for the enzyme binding. Others, especially the substances that bind to allosteric sites, can alter enzyme function without blocking the substrate binding to the active site, and are thus non-competitive. Moreover, binding of inhibitors can be reversible or irreversible. When the interaction is reversable, the enzyme can resume its function once the inhibitor detaches. However, when the binding is irreversible, the inhibitor never detaches from the enzyme and the enzyme becomes irreparably damaged and needs to be replaced. Nevertheless, enzyme inhibitors are useful as well. For instance, inhibitors have been utilized as antibiotics to inhibit bacterial growth, and as chemotherapeutics to inhibit the uncontrolled division of cancer cells6.

<h4>Measuring Enzyme Function</h4>

One method used by scientists to study the effects of different conditions on enzyme function is to quantify the reaction rate, which is how fast the enzyme is catalyzing the reaction. Therefore, a higher reaction rate indicates that the enzyme is catalyzing reactions more efficiently, whereas a lower rate means that it is working less efficiently. To determine the reaction rate, the reaction velocity is calculated by measuring the amount of product made per unit time. This is done by measuring the product concentration starting right at the beginning of the reaction when the product concentration is increasing linearly, until the enzyme is completely saturated with the substrate and the catalysis reaches a steady level. Once the baseline reaction rate is determined, it can be used as a reference point, or control, when comparing between a variety of treatments. We can assess reaction rates as relative or absolute measures. A relative reaction rate is a comparative measure that shows differences between two or more conditions, such as treatments in a single experiment, but does not give a value for what is being measured. An absolute reaction rate relies on a quantitative measure of the progress of the reaction. An easy way to understand the difference between relative and absolute reaction rates is to consider measuring the speed of a car in a race. A relative method would compare by assessing the ranking of cars at the finish line, whereas the absolute rate would assess and compare the speed of individual cars in miles per hour.

Since enzymes are so widely used, researchers have begun looking for ways to create and modify enzymes to suit specific needs, known as protein engineering. Recombinant DNA technology allows amino acid sequences to be changed in order to alter an enzyme&#8217;s shape or active site affinity. This has been used to create highly sensitive diagnostic tests for various conditions, as well as for bioremediation efforts and waste management tools7.

<h4>References</h4>

<ol class="references">
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	<li>Lomer MC, Parkes GC, Sanderson JD. Review article: lactose intolerance in clinical practice--myths and realities. Aliment Pharmacol Ther. 2008, Vol. 27, 2: 93-103.</li>
	<li>AR, Saltiel. New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. Cell. 2001, Vol. 104, 4: 517-29.</li>
	<li>DO, Kennedy. B Vitamins and the Brain: Mechanisms, Dose and Efficacy--A Review. Nutrients. 2016, Vol. 8, 2: 68 doi:10.3390/nu8020068.</li>
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	<li>Watson ID, Stewart MJ, Platt DJ. Clinical pharmacokinetics of enzyme inhibitors in antimicrobial chemotherapy. Clin Pharmacokinet. 1988, Vol. 15, 3: 133-64.</li>
	<li>Ahuja SK, Ferreira, GM, Moreira AR. Utilization of Enzymes for Environmental Applications. Crit Rev Biotech. 2004, Vols. 2-3, 125-54.</li>
</ol>

Enzyme Activity: Effect of pH and Temperature on Peroxidase Activity - Concept

Attività enzimatica

Biological Catalysts

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require ...

Didattica

JoVE Lab Manual

Processi cellulari

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

Valutazione della citotossicità e dell'integrità della membrana in fette polmonari tramite il saggio della lattato deidrogenasi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

Quantificazione dell'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

Cellular Immunodiagnostics

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

To measure the concentration of lactate, use a colorimetric assay kit to carry out duplicate analysis for the test samples. Add 10 microliters of the test samples to each well of a 96-well plate, and then add lactate assay buffer to each sample to adjust the volume to 50 microliters.
Dilute 100 millimolar L(+)-Lactate standard with lactate assay buffer to 1 millimolar. Then, into a series of wells, add 0, 2, 4, 6, 8, and 10 microliters of diluted L(+)-Lactate standard. Add 50 microliters of reaction mix into each well, and incubate at room temperature protected from light for at least 30 minutes for the color to develop.
Finally, use a microplate reader to measure the absorbance of each well at 570 nanometers. Subtract the absorbance of the background control mix from the absorbance of the reaction mix. Then, plot the lactate standard curve, and calculate the lactate concentrations from the curve by multiplying each concentration by 2.25.

Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio

Riepilogo

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