PAL foi financiado por um Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Este trabalho foi apoiado por um novo investigador MRC Research Grant (Sr/L010933/1) e pelo programa de MRC concede senhor/N026004/1 para PAL e pela bolsa de estudo BBSRC BB/M017222/1 a jato. Agradecemos a coorte de 2014-15 de aposentado parte 1 alunos da Universidade de Reading para tomar parte na primeira iteração deste coortes prático e subsequentes para seus comentários e sugestões.

Nota: O protocolo abaixo foi desenvolvido para ser realizado ao longo de duas horas (incluindo a conclusão de planilhas de classe) em um laboratório de ensino purpose-built. As etapas experimentais foram deliberadamente colocar juntos para excluir a análise mais detalhada da cinética enzimática (realizada no âmbito deste curso usando o modelo de dados); no entanto — conforme observado na discussão — o protocolo fornece um modelo para análises mais avançadas, dependendo do tempo, instalações e o nível de realização.
SEGURANÇA: Este prático deve ser efectuado de acordo com as regras da prática boa de laboratório químico (GCLP) — equipamento de protecção pessoal, incluindo o casaco de laboratório afivelados, luvas descartáveis e óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos no laboratório .
1. extrair a enzima
<ol><li>Esmaga um comprimido de lactase, contendo 200 mg de enzima, para um mesmo pó usando um almofariz e um pilão.</li>
	<li>Coloque o pó resultante em um tubo de 15 mL rotulados de "suspensão" e ressuspender em 10 mL de soro de 100 mM tamponado fosfato (PBS).</li>
	<li>Vórtice para 1 min maximizar a extração da enzima.</li>
	<li>Transferi 1 mL da suspensão para um tubo de 1,5 mL centrífuga e centrifugar por 1 min a 10.000 x g de partículas sólidas de sedimentos.</li>
	<li>Transferi 500 µ l do sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL rotulado "Extrato da Lactase".</li>
</ol>2. observar a reação colorimétrica
<ol><li>Lugar 390 µ l de PBS a 100 mM em um tubo de 1,5 mL rotulados "A reação".</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução ONPG 5mm e misture bem, num Vortex. Atenção: Esta prática usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) como um substituto para a lactose. Desde ONPG é um composto fenólico, devem ser manuseado com cuidado. Em caso de contacto com a pele com ONPG, a pele exposta deve ser lavada imediatamente. Todos os derramamentos devem ser limpou imediatamente com toalhas de papel para ser escoado o fluxo adequado de resíduos.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de extrato para o tubo de reação A e misture bem, num Vortex.</li>
	<li>Observar a mistura de reação por 5 minutos e observe quaisquer alterações colorimétricas para a solução.</li>
</ol>3. medir a atividade da enzima
<ol><li>Configurar dois tubos de 1,5 mL: um rotulado "Reação B", uma marcada "controle".</li>
	<li>Adicionar 390 µ l de PBS a 100 mM para a reação do tubo B, 400 µ l de PBS de 100 mM para o tubo de controle e em seguida, adicionar 100 µ l de ONPG de 5 mM a cada tubo.</li>
	<li>Misture o conteúdo num Vortex.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de extracto de lactase no tubo de reação B, misturar vortexing e permitir a reação proceder para 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Decorrido 1 min, adicione 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para ambos os tubos para inibir a enzima lactase, aumentando o pH, encerrando assim a reação.</li>
	<li>Transferir 500 µ l de cada tubo em cubetas de espectrofotômetro limpo e medir a absorbância a 420 nm, utilizando o Espectrofotômetro.</li>
	<li>Observe a absorvância para reação B e amostras de controle e em seguida, subtrair o valor do controle do valor de reação para derivar a mudança de absorbância devido à hidrólise de ONPG na presença da enzima activa.</li>
</ol>4. efeito da temperatura na atividade enzimática
<ol><li>Configurar o controle de três tubos e três tubos de reação conforme descrito na seção 3 e rotular estes "4 ° C", "Temperatura ambiente" e "37 ° C".</li>
	<li>Após a adição da enzima extrair, incubar um tubo no gelo, um em temperatura ambiente e um a 37 ° C (em um banho de água pré-aquecida).</li>
	<li>Permitir que as reações prosseguir por 1 min e então terminar a reação adicionando 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para cada tubo.</li>
	<li>Medir a absorbância a 420 nm para cada tubo, conforme descrito na seção 3. Registre os valores, subtraindo o valor do controle do valor de reação em cada caso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Um detalhado conhecimento e compreensão das enzimas, reações enzimáticas e cinética enzimática é necessária para uma vasta gama de tópicos abrangendo biologia, biomedicina e farmacologia. O protocolo descrito acima usa lactase como um exemplo de uma enzima relevante para a saúde humana, para demonstrar reações enzimáticas, fornecendo as competências-chave que podem ser usadas em experimentos de laboratório-baseado mais avançados.
Este protocolo foi deliberadamente concebido para ser tão robusto como possíveis, permitindo que os estudantes com pouca ou nenhuma experiência de laboratório molhado para produzir resultados interpretáveis em um curto espaço de tempo. No ano letivo de 2014/2015 da faculdade de farmácia da Universidade de Reading, um total de 144 estudantes, organizados em grupos de 3, realizado o experimento "medindo lactase", com todos os grupos capazes de detectar algum nível de atividade enzimática de tablet de lactase extratos.
Há uma série de passos críticos no presente protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a extração inicial seja eficiente, permitindo que a solubilização de suficiente enzima activa para análises subsequentes. Em nossa experiência, primeiro ano estudantes podem alcançar isto seguindo o protocolo descritos; no entanto algumas orientações de manifestantes de laboratório era necessária neste momento. Embora parece um ponto óbvio, um fator chave no sucesso deste protocolo é a capacidade de cuidadosamente medir volumes, corretamente rotular tubos e siga as instruções. Enquanto um certo nível de proficiência pode ser assumido por muitos alunos, monitoramento cuidadoso e um pedido claro para que os alunos pedir ajuda no caso em que eles não tem certo de o que fazer em seguida fornece a maior probabilidade de um ensaio bem sucedida.
Avaliação de estudante pode ser efectuada em-classe planilha (disponível como material suplementar), pedindo os alunos observar dados de experimentos, comentário sobre seus resultados e link para informações de plano de fundo/leitura do material da palestra, ou por mais detalhada, sem avaliação de classe com o modelo de dados fornecido permitindo análises cinéticas ser tentada e avaliada.
O protocolo apresentado aqui é um exemplo simples de um ensaio de atividade de lactase sob condições de laboratório de ensino, e há muitas oportunidades para aumentar a complexidade do experimento para permitir análises mais avançadas. Em particular, o protocolo apresentado fornece uma introdução ao conceito de cinética enzimática, mas não permite a análise cinética de dados experimentais. Como tal, recomendamos Visualizar o protocolo descrito como um modelo inicial para classes, com os detalhes precisos, adaptados para atender os objetivos específicos e talentos da coorte estudante realizar os experimentos. Exemplos de experimentos prolongados poderiam incluir: repetidas medições em diferentes temperaturas, usando concentrações de substrato diferentes para permitir a análise estatística, análise cinética de dados (apropriados para estudantes de bioquímica/majors), começando com vários comprimidos diferentes e permitindo que os alunos a avaliar diferente atividade da enzima em cada um (com a adição de tabuletas controle, apropriadas para estudantes de ciência forense/majors), avaliação do impacto de desnaturação térmica ou realização de competição experiências por adição de lactose ou inibidores de lactase (tabela 1). Um protocolo detalhado para análise cinética de lactase já havia sido publicado12.
Uma força importante deste protocolo é que ele combina uma introdução básica à cinética de enzimologia e enzima com um estudo de caso da vida real da enzimologia na medicina. Isso faz com que este laboratório experiência de particular relevância para os estudantes de medicina, farmácia, ciências biomédicas e assuntos relacionados. Importante, o fato de que haja uma condição médica séria e uma questão dietética mais generalizada associada com catabolismo à lactose fornece a oportunidade de criar uma vasta gama de questões éticas e médicas com os alunos. Isto poderia incluir as questões que envolvem testes genéticos para condições médicas e associado a discussões relacionadas a terapia genética e aconselhamento genético, bem como a utilização e venda de suplementos medicinais. Uma limitação importante é que o protocolo não permite a estimativa precisa da concentração de enzima, devido às matérias-primas usadas para a extração. Uma modificação para dar conta disto, no entanto, seria usar a enzima de grau reagente para o ensaio. Importante, isto também permitiria um cálculo mais preciso da cinética para a enzima lactase.
Em conclusão, análise da atividade da lactase em um laboratório de ensino ambiente fornece uma introdução robusta, atraente e interessante para o campo da biologia de enzima para fase inicial estudantes universitários.

As enzimas são um tipo especializado de proteína que agem como catalisadores biológicos, por reações químicas na vida organismos1. A ação de enzimas é fundamental para a vida, fornecendo energia, eliminação de resíduos e permitindo que os organismos funcionar. Enzimas de compreensão é, portanto, fundamental para uma compreensão completa da vida. Esse conhecimento é essencial para uma grande variedade de programas de grau de nível de Universidade, variando de ciências médicas de biologia. Enquanto um fundo detalhado desde princípios de catálise até modelos teóricos da atividade da enzima pode ser fornecido aos estudantes utilizando palestras e material de leitura, as propriedades de reacções enzimáticas são melhor compreendidas pelas mãos na experiência prática de enzimas em ação como previamente demonstraram2. Este protocolo fornece um simples para seguir o paradigma experimental para medir a atividade da enzima em condições de laboratório, utilizando lactase como um exemplo de uma enzima com uma actividade relevante para a saúde e nutrição humana.
A lactase hidrolase glicosídica (CE-3.2.1.23/26) é uma enzima de central importância nutricional para mamíferos3. A atividade da lactase é altamente conservada através da evolução e deriva da família de enzimas beta-galactosidase — uma família presente de Escherichia coli através de Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)4. A importância fundamental da lactase num cenário nutricional humano decorre de seu papel em permitir que a quebra da lactose em seus componentes monossacarídeos constituintes, que podem ser usados para gerar energia no corpo. Lactase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica em lactose dissacarídeo, liberando a galactose e a glicose (Figura 2)5. Esses monossacarídeos são usados principalmente para a geração de adenosina trifosfato (ATP) através do ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa6. Durante o desenvolvimento infantil e neonato, lactase é altamente expresso no sistema digestivo humano, quebrando à lactose recebida do leite materno de que lactose é o componente primário de hidrato de carbono e uma das principais fontes de nutrição durante os primeiros anos 7. a importância médica de lactase é destacada por deficiência de lactase congênita (CID), uma rara condição autossômica recessiva, causada por mutações no gene da lactase (LCT) que codifica para a enzima de lactase8. Recém-nascidos com CID apresentam pouca atividade de lactase, assim eles não podem ser alimentados com leite materno, qualquer outro tipo de leite ou fórmula que contenha lactose.
Durante a infância, expressão de lactase normalmente é reduzida; no entanto, esta redução após o desmame varia geograficamente, com aproximadamente 35% dos adultos em todo o mundo continua a expressar a enzima9. Expressão sustentado de lactase, conhecido como persistência da lactase, permite que indivíduos continuar a digerir leite e produtos lácteos de uma variedade de fontes. Por outro lado, a perda de expressão de lactase pode levar à intolerância à lactose, também conhecido como adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de uma incapacidade de quebrar a lactose no intestino. ATH é caracterizada por uma compilação acima de lactose no cólon após a ingestão de lactose, contendo produtos alimentares. No cólon, a lactose acumulada é fermentada pela fauna microbiana do intestino, liberando gases incluindo hidrogênio, metano e dióxido de carbono. A produção desses gases em indivíduos com deficiências de enzima lactase promover distensão abdominal, flatulência aumentada, dor, náusea e borborygmi (rumbling estômago)7. Aumento dos níveis de lactose no tracto digestivo também pode levar a fezes soltas.
O controle da expressão do gene LCT é modulado por polimorfismos localizados em intrões do gene MCM6 nas proximidades. Indivíduos com expressão sustentado de lactase carregam polimorfismos que funcionam como potenciadores distais fortes para a expressão do gene LCT , compensando assim o normal no Regulamento da transcrição de LCT durante o desmame e, consequentemente, sustentar a expressão de lactase na idade adulta3. Polimorfismos de potenciador sugeridos que foram selecionadas positivamente após a domesticação do gado e camelos no Oriente Médio há mais de cinco mil anos de9,10.
Os sintomas resultantes de ATH podem ser gerenciados por reduzir a ingestão de lactose, por exemplo, removendo produtos lácteos da dieta. Uma abordagem alternativa para ATH e a abordagem de escolha para CID, é o uso de suplementos de lactase, amplamente disponíveis em farmácias. Estes suplementos fornecem lactase isolado de uma variedade de fontes, incluindo leveduras e bactérias, em um formulário líquido ou comprimido-based que pode ser tomado com ou adicionado à lactose contendo alimentos. O suplemento vai hidrolisar uma proporção de lactose presente nos alimentos de produtos de glicose e galactose, assim permitindo a sua absorção e evitar o acúmulo de substrato de lactose não digerida no intestino.
Baseado no uso de suplementos de lactase, como uma dieta ajuda, nós desenvolvemos uma experiência de laboratório de enzimologia simples apropriada para primeiro ano biomédica ciência ou farmácia estudantes. Este experimento de laboratório aproveita-se de suplementos de lactase comercialmente disponível e usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) para fornecer um ponto de extremidade colorimétrico para medir a clivagem das ligações glicosídicas por lactase ( Figura 3)11. ONPG atua um substrato artificial para a lactase, que quando submetidos à hidrólise por esta enzima produz a D-galactose e orto-nitrofenol. O último produto tem uma cor amarela, absorve luz no comprimento de onda de 420 nm. Através da quantificação quaisquer alterações em absorvância a 420 seguinte nm a exposição de ONPG a lactase, é possível estimar a atividade desta enzima. Este experimento de laboratório fornece uma demonstração de atividade enzimática hidrolase. Construindo em repetições adicionais e realização de ensaios em diferentes condições, é possível incorporar mais sofisticadas análises de cinética enzimática, proporcionando um valioso exemplo de vida real de enzimas em ação relevante para a saúde humana.

<table><tbody><tr><td>Lactase tablet</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (powdered)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pestle and mortar</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing scales</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Compreender como funcionam as enzimas e isto aos exemplos da vida real, são fundamental para uma ampla gama de graduação em ciências biológicas e biomédicas. Tão fácil de seguir protocolo foi desenvolvido para estudantes de graduação de farmácia primeiros ano e fornece uma introdução de nível básico de reacções enzimáticas e procedimentos analíticos para análise enzimática. A enzima de escolha é a lactase, como este representa um exemplo de uma enzima disponível comercialmente relevante para a prática de doença humana/farmacêutica. Lactase é extraído de comprimidos de suplemento dietético e avaliados usando um ensaio colorimétrico baseado a hidrólise de um substrato artificial para lactase (Orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Lançamento do Orto-nitrofenol após a clivagem hidrolítica de ONPG pela lactase é medido por uma alteração na absorbância a 420 nm e o efeito da temperatura sobre a reação enzimática é avaliada por realizar a reação no gelo, à temperatura ambiente e em 37 ° C. Análise mais avançada pode ser implementada usando este protocolo, avaliar a atividade da enzima em condições diferentes e usando diferentes reagentes.

Resultados representativos para a seção 2 do protocolo são mostrados na Figura 4A. A reação de controle, na ausência da enzima lactase, permanece clara enquanto a solução de reação, contendo extrato do comprimido de lactase, fica amarela como ONPG é hidrolisado liberando orto- nitrofenol. Figura 4B mostra a quantificação utilizando unidades arbitrárias da secção 4 do protocolo, seguir análise de amostras usando o Espectrofotômetro. Produção de orto-nitrofenol é mais baixa quando a reação é incubada no gelo e mais alto quando a reação é realizada a 37 ° C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Figura 1 : Escherichia coli beta-galactosidase. (A) estrutura de cristal da beta-galactosidase de Escherichia coli, mostrando a estrutura tetramérica da ativo complexo. (B) Allolactose (mostrado em vermelho) ligado ao sítio ativo da beta-galactosidase. Imagens geradas a partir de PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Figura 2 : Acção enzimática de lactase. Hidrólise da lactose por lactase para produzir beta-D-galactose e beta-D-glicose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Figura 3 : Hidrólise de orto-nitrofenol - beta -D-galactopyranoside. Hidrólise ONPG pela lactase para produzir beta-D-galactose e orto-nitrofenol (que é na cor amarela), que permite a estimativa da atividade da lactase de medição de absorbância a 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Figura 4 : Hidrólise ONPG. Resultados representativos de hidrólise ONPG, mostrando tubos de controle e reação (A) e dados representativos da secção 4 do protocolo registrados em planilhas em sua classe, mostrando a absorvância cru em unidades arbitrárias em 420 nm, corrigida para o fundo e em três temperaturas diferentes (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Condição experimental</td>
			<td>Variáveis experimentais</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentração de substrato</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibição competitiva</td>
			<td>à lactose ONPG além de 0 mM, 1 mM, 5 mM ou 10 mM 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dependência do tempo</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação térmica</td>
			<td>Extrato da lactase aquecido a 100 ° C durante 10 min antes de ensaio</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: potencial estendido condição experimental. Sugere-se experiências estendidas, a efectuar em triplicado, investigar aspectos específicos da biologia do lactase.

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Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

A atividade enzimática da lactase é essencial para o processamento catabólico de lactose o dissacarídeo. Aqui, a atividade da lactase encontrado em suplementos dietéticos é analisada usando um ensaio colorimétrico. Isto fornece aos alunos uma plataforma experimental para a compreensão da atividade da lactase e enzima cinética.

Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Bioquímica

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Ambiente

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Bioengenharia

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Enzyme Activity

<h4>Biological Catalysts</h4>

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require an input of energy to start, which is called the activation energy. Catalysts are chemicals that lower the activation energy. Even though catalysts facilitate a chemical reaction, they are not consumed by it. This means a catalyst can facilitate a specific chemical reaction over and over in succession, increasing the rate of that reaction.

Enzymes are biological catalysts that increase the speed and efficiency of biochemical reactions. Most enzymes are proteins but certain ribonucleic acid molecules also have catalytic properties. Each type of enzyme can only bind to one or a few specific substrates, therefore, there is a vast diversity of enzymes, all with distinct functions. The specific reaction of an enzyme depends on its active sites, which has shapes that closely matches the shape of its substrates. Upon substrate binding, the enzyme changes shape slightly in a way that allows the chemical reaction to happen more readily, thus reducing the activation energy of the reaction. Once the reaction takes place, the enzyme releases the products and returns to its original shape, which allows it to repeat the process again.

<h4>Catabolytic versus Anabolic Enzymes</h4>

Most enzymatic reactions can be categorized as either catabolic and anabolic, which have opposite functions. Enzymes that mediate catabolic reactions break down larger substances into multiple products. A well-known catabolic enzyme is lactase, which splits the disaccharide lactose in dairy products into monosaccharides galactose and glucose. Humans have large amounts of lactase in their small intestine after birth, however many individuals lose more than 90% of their lactase by early childhood1. This reduction diminishes the ability to digest lactose in an age-dependent manner, which is known as lactose intolerance2.

Anabolic enzymes combine multiple substances into a single product. For example, the enzyme DNA polymerase synthesizes DNA molecules by joining nucleotides together. Similarly, the enzyme glycogen synthase connects glucose molecules to generate glycogen. Insulin regulates the activity of glycogen synthase, therefore diabetic patients with low to no insulin levels cannot synthesize glycogen without insulin treatment3.

<h4>Environmental Factors</h4>

The shape and charge of the active site of an enzyme is tailored to the specific chemical reaction it catalyzes, therefore the enzyme activity is influenced by factors that affect its active site. Hence, enzymes require specific conditions to work at optimal levels and depending on their function and location, these conditions can vary greatly. These factors include pH and temperature. For example, active sites of enzymes often contain acidic or basic amino acids. Deviations from the optimum pH alter the charges in the active site, making it difficult for the substrates to interact with the enzyme. This property has been used for centuries to preserve food by pickling, which reduces the pH of the pickled food item to a level that effectively inhibits microbial enzymatic activity. Similarly, each enzyme works at an optimal temperature range. If the temperature shifts below or above this range, it alters the shape of the active site, preventing it from effectively interacting with its substrates. In most cases, returning to the optimal temperature restores the enzyme&#8217;s original shape and function, however, temperatures that are too high can denature or irreversibly damage the enzyme structure. Again, these properties are useful for food safety; we cook meat thoroughly to kill harmful bacteria by denaturing their enzymes and refrigerate most food items to slow down enzymatic activity of microorganisms.

Extremophiles, or organisms found in extreme conditions that are lethal to most forms of life, have enzymes capable of functioning at those extremes. For instance, Thermus aquaticus is a bacterium found in hot springs and hydrothermal vents reaching temperatures at which most proteins would denature. Taq polymerase is a thermostable DNA polymerase found in T. aquaticus, which has allowed the development of polymerase chain reaction (PCR), a widely-used laboratory method for rapid DNA replication. PCR requires high temperatures to separate the strands of the DNA double helix to be replicated. Taq polymerase remains stable at these high temperatures while most enzymes would be degraded. PCR cycles between high temperatures that break the DNA into single strands and lower temperatures that allow the polymerase to build new double stranded DNA.

<h4>Molecular Factors that Influence Enzyme Activity</h4>

In addition to specific pH and temperature ranges, some enzymes function better in the presence of other molecules or ions. Coenzymes are biomolecules that bind to the active site of the enzyme and participate in catalysis without getting consumed by the reaction. Coenzymes often transport electrons, specific atoms and functional groups, and thus act as intermediary carriers. B vitamins act as coenzymes for numerous biochemical reactions. For instance, coenzyme A (coA), which is the active form of pantothenic acid, is required by 4% of all mammalian enzymes4. Cofactors are often classified as inorganic substances, such as ions, that are required for the enzymatic function. For example, all DNA polymerase enzymes require Mg2+ or Mn2+ for DNA replication as well as excision of incorrectly incorporated nucleotides5.

There are also other molecules that are not necessary for an enzyme to function but are capable of altering the enzymatic activity. Substances that increase the enzyme activity are called activators, whereas others that decrease the enzyme activity are called inhibitors. These molecules bind to enzymes either at the active site or other locations on the enzyme known as allosteric sites. Sometimes these molecules can bind to the exact location in the active site as the substrate, and thus compete with the substrate for the enzyme binding. Others, especially the substances that bind to allosteric sites, can alter enzyme function without blocking the substrate binding to the active site, and are thus non-competitive. Moreover, binding of inhibitors can be reversible or irreversible. When the interaction is reversable, the enzyme can resume its function once the inhibitor detaches. However, when the binding is irreversible, the inhibitor never detaches from the enzyme and the enzyme becomes irreparably damaged and needs to be replaced. Nevertheless, enzyme inhibitors are useful as well. For instance, inhibitors have been utilized as antibiotics to inhibit bacterial growth, and as chemotherapeutics to inhibit the uncontrolled division of cancer cells6.

<h4>Measuring Enzyme Function</h4>

One method used by scientists to study the effects of different conditions on enzyme function is to quantify the reaction rate, which is how fast the enzyme is catalyzing the reaction. Therefore, a higher reaction rate indicates that the enzyme is catalyzing reactions more efficiently, whereas a lower rate means that it is working less efficiently. To determine the reaction rate, the reaction velocity is calculated by measuring the amount of product made per unit time. This is done by measuring the product concentration starting right at the beginning of the reaction when the product concentration is increasing linearly, until the enzyme is completely saturated with the substrate and the catalysis reaches a steady level. Once the baseline reaction rate is determined, it can be used as a reference point, or control, when comparing between a variety of treatments. We can assess reaction rates as relative or absolute measures. A relative reaction rate is a comparative measure that shows differences between two or more conditions, such as treatments in a single experiment, but does not give a value for what is being measured. An absolute reaction rate relies on a quantitative measure of the progress of the reaction. An easy way to understand the difference between relative and absolute reaction rates is to consider measuring the speed of a car in a race. A relative method would compare by assessing the ranking of cars at the finish line, whereas the absolute rate would assess and compare the speed of individual cars in miles per hour.

Since enzymes are so widely used, researchers have begun looking for ways to create and modify enzymes to suit specific needs, known as protein engineering. Recombinant DNA technology allows amino acid sequences to be changed in order to alter an enzyme&#8217;s shape or active site affinity. This has been used to create highly sensitive diagnostic tests for various conditions, as well as for bioremediation efforts and waste management tools7.

<h4>References</h4>

<ol class="references">
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	<li>AR, Saltiel. New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. Cell. 2001, Vol. 104, 4: 517-29.</li>
	<li>DO, Kennedy. B Vitamins and the Brain: Mechanisms, Dose and Efficacy--A Review. Nutrients. 2016, Vol. 8, 2: 68 doi:10.3390/nu8020068.</li>
	<li>Vashishtha AK, Wang J, Konigsberg WH. Different Divalent Cations Alter the Kinetics and Fidelity of DNA Polymerases. J Biol Chem. 2016, Vol. 291, 40: 20869-20875.</li>
	<li>Watson ID, Stewart MJ, Platt DJ. Clinical pharmacokinetics of enzyme inhibitors in antimicrobial chemotherapy. Clin Pharmacokinet. 1988, Vol. 15, 3: 133-64.</li>
	<li>Ahuja SK, Ferreira, GM, Moreira AR. Utilization of Enzymes for Environmental Applications. Crit Rev Biotech. 2004, Vols. 2-3, 125-54.</li>
</ol>

Enzyme Activity: Effect of pH and Temperature on Peroxidase Activity - Concept

Atividade enzimática

Biological Catalysts

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require ...

JoVE Lab Manual

Processos Celulares

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

Avaliação da citotoxicidade e integridade da membrana em fatias pulmonares por meio do ensaio de lactato desidrogenase

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

Cellular Immunodiagnostics

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

To measure the concentration of lactate, use a colorimetric assay kit to carry out duplicate analysis for the test samples. Add 10 microliters of the test samples to each well of a 96-well plate, and then add lactate assay buffer to each sample to adjust the volume to 50 microliters.
Dilute 100 millimolar L(+)-Lactate standard with lactate assay buffer to 1 millimolar. Then, into a series of wells, add 0, 2, 4, 6, 8, and 10 microliters of diluted L(+)-Lactate standard. Add 50 microliters of reaction mix into each well, and incubate at room temperature protected from light for at least 30 minutes for the color to develop.
Finally, use a microplate reader to measure the absorbance of each well at 570 nanometers. Subtract the absorbance of the background control mix from the absorbance of the reaction mix. Then, plot the lactate standard curve, and calculate the lactate concentrations from the curve by multiplying each concentration by 2.25.