PAL は、パーキンソン病英国研究員 (グラント F1002) によって資金を供給されました。この仕事は MRC 新しい調査研究助成 (氏/L010933/1) によって支えられた、BBSRC 就労 BB/M017222/1 ジェットに、pal、MRC プログラムによって氏/N026004/1 を付与します。MPharm パート 1 学生のフィードバックと入力この実用的なおよびそれ以降のコホートの最初のイテレーションに参加のための読書の大学の 2014-15 コホートに感謝いたします。

注: 以下のプロトコル (クラスのワークシートの補完を含む) 2 時間にわたって開催される専用教育研究室で開発されました。実験の手順が意図的に酵素反応速度論 (実施モデル データを使用してこのコースのコンテキストで); の詳細な分析を除外に入れてただし、前述の議論-プロトコルは、時間、設備、学生の達成レベルに応じてより高度な分析用のテンプレートを提供します。
安全性: この実用的なべきである良い化学実験室の練習 (GCLP) の規則に従って、個人用保護具、留められた白衣、使い捨て手袋、安全メガネなどに着用するべきすべての回、研究室で.
1. 酵素を抽出
<ol><li>乳鉢と乳棒を使用しても粉に酵素の 200 mg を含む 1 つの乳糖分解酵素タブレットをつぶします。</li>
	<li>「懸濁液」をラベル 15 mL チューブに結果の粉を置き、100 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 mL で再懸濁します。</li>
	<li>酵素の抽出を最大化するために 1 分の渦。</li>
	<li>堆積物の固体の粒子に、懸濁液から 1.5 mL 遠心チューブ ・遠心 10,000 × gで 1 分に 1 mL を転送します。</li>
	<li>ラベル「乳糖分解酵素エキス「クリーン 1.5 mL チューブに上清を 500 μ l 添加を転送します。</li>
</ol>2. 比色反応の観察
<ol><li>1.5 mL チューブに 100 mM PBS の場所 390 μ L はラベル「反応 A」です。</li>
	<li>ボルテックスでよく 5 mM ONPG ソリューションとミックスの 100 μ L を追加します。 注意: この実用的な使用オルト-ニトロフェノール -ベータ-D-ガラクトピラノシド (ONPG) 乳糖の代用として。ONPG フェノール化合物である、ために、注意して処理する必要があります。ONPG が肌に接触した場合露出した皮膚をすぐに洗浄する必要があります。適切な廃棄物の流れに処分するペーパー タオルでこぼれすぐに拭いてください。</li>
	<li>ボルテックスでよく反応がチューブとミックスに抽出液の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>5 分間反応混合物を観察し、ソリューションに比色変更に注意してください。</li>
</ol>3. 酵素活性の測定
<ol><li>2 つの 1.5 mL チューブを設定:"反応 B"、1 つのラベル「コントロール」のラベルの 1 つ。</li>
	<li>B 管、制御管 100 mM PBS の 400 μ L 反応する 100 mM PBS の 390 μ L を追加し、各管に 5 mM ONPG の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>ボルテックスによって内容をミックスします。</li>
	<li>反応 B 管に乳糖分解酵素抽出液の 10 μ L を追加、ボルテックスでミックス、室温で 1 分進む反応ができます。</li>
	<li>1 分が経過すると、それによって反応を終了させる、pH を増やすことによってラクターゼの酵素を阻害する両方のチューブに 1 M 炭酸ナトリウム 500 μ L を追加します。</li>
	<li>きれいな分光光度計のキュベットに各チューブから 500 μ L を転送し、420 で吸光度を測定分光光度計を用いた nm。</li>
	<li>ONPG の活性酵素の存在下で加水分解による吸光度の変化を派生させる反応値からコントロールの値を減算し、反応 B、コントロール サンプルの吸光度を注意してください。</li>
</ol>4 酵素活性に及ぼす温度の影響
<ol><li>セクション 3 で説明した 3 つの制御管および 3 つの反応管を設定し、これらのラベル「4 ° C」、「室温」と「37 ° C」.</li>
	<li>以下の酵素の付加を抽出し、1 つの管、室温で、37 ° c (中古温水バス) での氷を孵化させなさい。</li>
	<li>1 分進み、各チューブに 1 M 炭酸ナトリウム 500 μ L を追加することによって、反応を終了する反応を許可します。</li>
	<li>測定吸光度 420 nm のセクション 3 で説明した各チューブ。それぞれのケースで反応値からコントロールの値を減算値を記録します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

詳細な知識と酵素、酵素反応、酵素反応速度論の理解は生物学、生物医学、薬理学にまたがるトピックの広い範囲に必要です。上記プロトコルより高度な実験室の実験で使用することができますキーのスキルを提供する酵素の反応を示すため、人間の健康に関連する酵素の例として乳糖分解酵素を使用します。
このプロトコルは、意図的にできるように、可能な限り生徒の時間の短いスペースで解釈の結果を生成するほとんどあるいは全くのぬれた実験室の経験と堅牢に設計されています。レディング大学薬学院で 2014/2015 年度の延べ 144 名の生徒、3 のグループに分類がラクターゼ タブレットからの酵素の活動のいくつかのレベルを検出することができるすべてのグループで、「乳糖分解酵素を測る」実験を実施抽出します。
このプロトコルの重要なステップの数があります。まず、最初の抽出、効率的で、以降の解析に十分な活性酵素の可溶化を許可することが必須です。私たちの経験では最初の 1 年生これで実現できますプロトコルを次のとおり。しかし研究所デモ参加者からいくつかのガイダンスがこの時点で必要でした。自明のポイントに思えるが、このプロトコルの成功の重要な要因は、慎重に体積測定、正しくチューブにラベルを付けるし、指示に従ってください。多くの学生、入念な監視と彼らがわからない場合に、支援を求める学生のための明確な要求をある程度語学力が想定される場合何をするか次に正常な試金の最大の可能性を提供します。
クラスのワークシート (補足資料として利用できる)、実験、結果、講義資料、背景情報/読書へのリンクにコメント データをメモする学生を求めてより学生の評価を実施することができます。クラス評価試行し評価の速度論的解析を可能にする提供されるモデル データから詳細な。
ここに提示されたプロトコルは教育研究室の条件下で乳糖分解酵素の活性測定法の簡単な例より高度な分析を許可する実験の複雑さを増やす十分な機会があります。特に、提案するプロトコルは酵素反応速度論の概念を紹介しますが、実験データの速度論的解析を許可しません。そのため、特定の目的や実験を行う学生コホートの才能に合わせて適応した精密なディテールとクラスの初期テンプレートとして記述されているプロトコルを表示するをお勧めします。拡張実験の例は含むことができる: 繰り返し異なる温度、異なる基質濃度を使用して統計分析、始まる (生化学の学生/専攻分野に適した)、データの速度論的解析で測定いくつかの異なる錠剤 (コントロールの錠剤、法医学専攻学生に適した添加) それぞれに酵素活性を評価する学生を許可する、熱変性の影響の評価や競争の実施乳糖の添加、またはラクターゼ (表 1) の阻害剤を用いた実験。乳糖分解酵素の速度論的解析のための詳しいプロトコルは、以前公開された12をされて。
このプロトコルの重要な強さは医学における酵素学の現実事例研究、酵素学や酵素反応速度論の基本的な紹介と組み合わせています。これは当研究室を医学、薬学、生物医学科学、関連科目の学生に特に関連の実験。重要なは、深刻な病状と乳糖分解に関連するより広範な食問題があるという事実は、学生では医療と倫理的な問題の広い範囲を高めるための機会を提供します。これは医療の条件のための遺伝学的検査にまつわる問題を含めることができます、遺伝子治療、遺伝相談と同様に使用および医薬品サプリメントの販売に関するディスカッションを関連付けられています。1 つの主要な制限は、抽出用の原料のための酵素濃度の正確な推定のプロトコルができないことです。このため、アカウントへの変更ただし、アッセイ用試薬グレードの酵素を使用するでしょう。重要なは、ラクターゼ酵素の動力学のより正確な計算のためことができます。
試金活動の結論としては、教育実習でラクターゼの環境提供初期段階の酵素学のフィールドに堅牢な魅力的で興味深い紹介大学生。

酵素は生物体内の化学反応触媒として機能するタンパク質の一種の生物1。生活、エネルギーを提供する、廃棄物の処理と生物機能を許可するための酵素の働きが欠かせません。したがって、理解酵素は生命の完全な理解のために重大です。そのような知識は、大学レベルの学位プログラム、医科学から生物学に至るまでのさまざまな不可欠です。酵素反応の特性はの実用的な経験の手によって理解最高触媒の原理から酵素活性の理論モデルに至るまで詳細な背景は、生講義を行い、読み物に提供できる、アクションで酵素は前述2を示した。このプロトコルでは、単純な人間の栄養と健康に関連する活動に酵素の例として乳糖分解酵素を用いた実験室条件下での酵素活性を測定する実験パラダイムに従うことを提供します。
グリコシドの加水分解酵素ラクターゼ (EC 3.2.1.23/26) は、哺乳類3の中央の栄養の重要性の酵素です。ラクターゼの活性、進化の過程で保存性が高いと酵素の β-ガラクトシダーゼ家族から派生-家族を大腸菌からホモ ・ サピエンス(図 1、PDB 1JZ8)4に存在します。人間の栄養設定で乳糖分解酵素の重要性はの構成単糖のコンポーネントについては、体内でエネルギーを生成する使用できますに乳糖の分解を許可する役割に由来します。ラクターゼは、二糖類の乳糖は、ガラクトースとグルコース (図 2) 解放のグリコシド結合の加水分解を触媒する5。これらの単糖は、アデノシン三リン酸 (ATP)経由でクエン酸回路、酸化的リン酸化6生成のために主に使用されます。新生児と幼児の開発の段階の乳糖分解酵素を高発現して母乳の乳糖の早い年の間にプライマリ炭水化物組成と栄養の原因の 1 つから受け取った乳糖を分解、人間の消化器系の7. 先天性乳糖分解酵素欠損症 (CLD)、ラクターゼ酵素8符号化 (LCT) ラクターゼ遺伝子で突然変異によって引き起こされるまれな常染色体優性劣性状態によってラクターゼの医療の重要性が強調表示されます。CLD と新しい生まれた赤ちゃん展示非常に少ないラクターゼの活動、したがって母乳、ミルク、または乳糖を含む数式の他のタイプの給紙できません。
小児期にラクターゼ表現が通常減少しました。ただし、この低減離乳は酵素9を表現する大人の世界的な継続のおよそ 35% の地理的に異なります。Lactase と呼ばれるラクターゼの持続的な表現では、情報源の範囲から牛乳や乳製品の製品を消化していく個人ことができます。逆に、ラクターゼ表現の損失は、乳糖不耐症、またとして知られている成人型 hypolactasia (ATH)、腸内の乳糖を分解することができないことに起因する可能性があります。ATH は乳糖乳糖を含む食品の摂取に続くコロンのビルドが特徴です。コロン、蓄積された乳糖を発酵して腸内微生物相、水素、メタン、二酸化炭素などのガスを放出します。腹部膨満、放屁増加、苦痛、悪心、および borborygmi (胃ゴロゴロ)7ラクターゼ酵素欠損を持つ個人でこれらのガスの生産を促進します。乳糖の消化管の増加されたレベルは軟便にもつながります。
LCT遺伝子発現の制御は、近くのMCM6遺伝子のイントロンにある多型による変調されます。ラクターゼの持続的な表現を持つ個人を運ぶ相殺離乳、 LCT転写制御を通常LCT遺伝子発現に強い遠位エンハンサーとして機能する遺伝子多型とその結果成人3ラクターゼ表現を維持します。エンハンサーの多型は、積極的に選択された次の牛と中東地域でのラクダの家畜化五千年以上前に提案されている9,10。
ATH から起きる症状は、たとえばダイエットから酪農製品を削除することによって乳糖の摂取量を減らすことによって管理できます。ATH のための別のアプローチ、CLD、最適なアプローチは、薬局から広く利用可能、乳糖分解酵素サプリメントの使用です。これらのサプリメントは、さまざまなソース、液体または錠剤形式で撮影または乳糖含有食品に追加することができますで酵母や細菌を含むから分離された乳糖分解酵素を提供します。サプリメントは、乳糖をグルコースとガラクトース製品、こうして吸収を許可して、腸内に未消化の乳糖の基質の蓄積を防止する食糧で現在の割合を加水分解されます。
栄養の補助として乳糖分解酵素サプリメントの使用に基づいて、最初年の生物医学の科学または薬局生に適した単純な酵素学研究室実験を開発しました。この実験を活用して市販乳糖分解酵素サプリメントや使用されているオルソ-ニトロフェノール -β-d ガラクトピラノシド ラクターゼ (によってグリコシド結合の開裂を測定する比色終点を提供する (ONPG)図 3)11。ONPG 行為、ラクターゼの人工基質をこの酵素による加水分解生成 D-ガラクトースとオルト-ニトロフェノールを受けるとき。後者の製品は 420 の波長の光を吸収、黄色 nm。吸光度 420 nm 以下の任意の変化を定量化することでラクターゼを ONPG の露出、それはこの酵素の活性を推定することが可能。この実験は酵素の加水分解酵素の活動のデモンストレーションを提供します。追加のレプリケートの建物と異なる条件の試金を遂行、酵素反応速度論、人間の健康に関連する行動における酵素の貴重な実例を提供することのより高度な解析を組み込むことが可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

酵素が働く仕組みを理解し、実際の生活の例には、この関係は、幅広い生物学的および生物医学科学の学士に不可欠です。このわかりやすいプロトコル 1年生学部薬局用に開発された、酵素分析のため酵素反応と分析的手続入門のエントリー レベルを提供します。好みの酵素はラクターゼは、これは人間の病気/製薬練習に関連する市販酵素の例を表します。乳糖分解酵素は栄養補助食品の錠剤から抽出され、ラクターゼの人工基質の加水分解に基づく比色定量法を用いて評価した (オルト-ニトロフェノール -ベータ-D-ガラクトピラノシド、ONPG)。オルト-ニトロフェノール ラクターゼによって ONPG の加水分解の開裂、次のリリースが 420 で吸光度の変化によって測定される nm、および酵素反応に及ぼす温度は氷、37、常温での反応を行うことにより評価° C.高度な解析は、異なる条件下で酵素活性を評価し、異なる試薬を使用してこのプロトコルを使用して実装できます。

プロトコルのセクション 2 の代表的な結果は、図 4 aに表示されます。コントロールの反応は、ラクターゼ酵素の不在で解放 ONPG を加水分解、ラクターゼ タブレットからの抽出物を含む反応溶液が黄色に変わりながら明確に残るオルソ- ニトロフェノール。図 4 bは、定量化のプロトコル、分光光度計を用いた試料の分析を次のセクション 4 から任意の単位を使用してを示しています。オルト-ニトロフェノールの生産は反応は氷、培養するとき最小値と最大 37 ° C で反応を行った場合
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> 図 1:大腸菌 β-ガラクトシダーゼ。(A)エシェリヒア属大腸菌アクティブの 4 量体構造に複雑な表示から β-ガラクトシダーゼの結晶構造。(B) Allolactose (赤色で表示) は、β-ガラクトシダーゼの活性部位にバインドされます。PDB 1JZ84から生成されたイメージ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> 図 2:ラクターゼの酵素作用します。ベータ版 D-ガラクトースと β-グルコースを生成するラクターゼがラクトースの加水分解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> 図 3:加水分解オルト-ニトロフェノール -ベータ版-D-ガラクトピラノシド。ベータ版 D-ガラクトースとオルト-ニトロフェノール (黄色の色である)、420 で吸光度の測定によってラクターゼ活性の推定を許可するを生成するラクターゼによって ONPG 分解 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> 図 4:ONPG 分解します。ONPG 加水分解の代表的な結果は、コントロールと反応管 (A) とプロトコルのセクション 4 から代表的なデータを示す生吸光度を示す 420 で任意の単位でクラスのワークシートに記録された nm、背景の修正と3 種類の温度 (B) で<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>実験条件</td>
			<td>実験変数</td>
		</tr>
<tr>
<td>温度</td>
			<td>0 の ° C、10 ° C、20 ° C、30 ° C、50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>基質濃度</td>
			<td>0、1 mM、5 mM、10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>競争阻害</td>
			<td>5 mM ONPG プラス 0 mM、1 mM、5 mM または 10 mM の乳糖</td>
		</tr>
<tr>
<td>時間依存性</td>
			<td>0 秒、15 秒、30 秒、1 分、5 分、10 分、20 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>熱変性</td>
			<td>試金する前に 10 分の 100 ° C に加熱して乳糖分解酵素エキス</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 潜在的な実験条件を拡張。3 通、乳糖分解酵素の生物学の特定の側面を調査実施の拡張の実験を提案しました。

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Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

ラクターゼの酵素活性は、二糖類の乳糖の分解処理に不可欠です。ここでは、栄養補助食品は、乳糖分解酵素の活性は、比色試金を使用して試金されるが。これは乳糖分解酵素と酵素の活動を理解するため実験プラットフォームを持つ学生を提供します。

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

measuring-lactase-enzymatic-activity-in-the-teaching-lab

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Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

112.7K ビュー.  University of Reading. ラクターゼの酵素活性は、二糖類の乳糖の分解処理に不可欠です。ここでは、栄養補助食品は、乳糖分解酵素の活性は、比色試金を使用して試金されるが。これは乳糖分解酵素と酵素の活動を理解するため実験プラットフォームを持つ学生を提供します。

ビデオ: Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

生物学

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、<em&gt;ヒトスジシマカ</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the mouse provides great potential to explore cardiac function at the molecular level. The mouse&#39;s small size does present some challenges in regards to performing detailed cardiac phenotyping. Miniaturization and other advancements in technology have made many methods of cardiac assessment possible in the mouse. Of these, the simultaneous collection of pressure and volume data provides a detailed picture of cardiac function that is not available through any other modality. Here a detailed procedure for the collection of pressure-volume loop data is described. Included is a discussion of the principles underlying the measurements and the potential sources of error. Anesthetic management and surgical approaches are discussed in great detail as they are both critical to obtaining high quality hemodynamic measurements. The principles of hemodynamic protocol development and relevant aspects of data analysis are also addressed.

This manuscript describes a detailed protocol for the collection of pressure-volume data from the mouse.

マウスで圧力ボリュームループを測定します

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...