Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de apoyo Fondos de Investigación (RSFG) de la Universidad de Indiana-Purdue University, Indianapolis, y en parte por un premio de la Asociación Americana del Corazón 14GRNT20390154, a ARCA

1. Expresión bacteriana. Nota: Los plásmidos de expresión utilizados en este estudio se describen en la Tabla 1. Soluciones, los medios y tampones utilizados en este estudio se describen en la Tabla 2. La clonación de genes de la subunidad del proteasoma archaeal y la generación de plásmidos de expresión se describen en otro 18,20. En resumen, los plásmidos de coexpresión recombinante de subunidades emplean una estrategia operón bicistrónico que ayuda en la obtención de niveles de expresión comparables de subunidades individuales 18,20. Los parámetros de expresión se indican a continuación fueron determinada empíricamente para ser óptimo para las subunidades del proteasoma en este estudio. Puede ser necesario para optimizar la expresión de otros mutantes del proteasoma, por proteasomas de otras especies archaeal, o para otros complejos de proteína recombinante (ver Discusión). <ol><li> Transformar el plásmido de expresión de interés en químicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) células. </li><li> Añadir 1 - 2 l de plásmido (típicamente de 50 - 100 ng) a una alícuota de células DE3 que estaban recién descongelado en el hielo, y continúe a incubar en hielo durante 20 min. </li><li> choque térmico de las células a 42ºC durante 45 s y el tubo de retorno de hielo durante 2 min additionl. </li><li> Añadir 1 ml de medio LB y se incuba a 37 ° C con agitación (150 rpm) durante 1 h. </li><li> Spread 100-200 l de la mezcla de transformación sobre LB-kan placas (placas que contienen medio sólido LB, suplementado con kanamicina (todos los plásmidos utilizados en este estudio resistencia codificar a este antibiótico)). Incubar las placas a 37 ºC O / N. </li><li> A la mañana siguiente, inocular una única colonia de la placa de LB-kan en 3 ml de medio LB-kan líquido en un tubo de cultivo de vidrio. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 2,5 a 3 h, o hasta que se observa turbidez. </li><li> Medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) en un espectrofotómetro. Diluir el culto celularUre con una cantidad apropiada de medio LB precalentada-Kan a un OD 600 de 0,4 en un volumen final de 6 ml. Reanudar la agitación a 37 ºC durante 40 min. </li><li> Inducir la expresión de proteínas en los cultivos líquidos mediante la adición de IPTG a partir de una solución madre a una concentración final de 1 mM. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 6-7 h. </li><li> Cosechar cultivos de células bacterianas en su totalidad en tubos de 1,5 mL microcentrífuga. </li><li> Añadir 1,5 ml de un cultivo en tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir otros 1,5 ml de la misma cultura de la pastilla. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Repita el paso 1.11 hasta que todo el cultivo se recoge en el tubo de microcentrífuga. </li><li> Almacenar los pellets inducidos a -80 ° C hasta su lisis. </li></ol> 2. bacteriana de lisis y el lisado de mezcla. Nota: </strong&gt; Para las muestras estudiadas a través de la co-expresión, la sección 2.1 (y sus subsecciones) seguir. Para las muestras que requieren mezcla lisado, sección 2.2 (y sus subsecciones) seguir. El análisis TSP (Total, Soluble, Pellet) que se incluye en el protocolo es útil en la optimización de la expresión de proteínas que pueden ayudar a asegurar que cantidades aproximadamente iguales de subunidades alfa y beta se combinan durante la mezcla de lisado (ver Discusión). También proporciona un control importante, si no son los esperados resultados aguas abajo (es decir, se verifica que la proteína se expresó y soluble). Por lo tanto, es muy recomendable que incluye el análisis de TSP inicialmente. Una vez que un protocolo óptimo se ha logrado una combinación de subunidades particular, el análisis TSP no es estrictamente necesario por lo que se describe como opcional a continuación. <ol><li> La lisis de las células bacterianas y la preparación de fracciones solubles. <ol><li> Descongelar el pellet de células inducida en hielo durante 5 min. Resuspender el precipitado en 600 l de tampón de lisis. </li><li> CªUbaté la suspensión a 30 ° C con agitación (150 rpm) durante 30 min para generar lisado bruto total. Nota: En el siguiente paso, y la subsección que sigue son opcionales. </li><li> Retire los dos 25 alícuotas del lisado total de crudo en 1,5 ml tubos de microcentrífuga separados y llevar a cabo análisis de TSP de la siguiente manera. <ol><li> Para uno de los dos 25 alícuotas, añadir tampón de muestra SDS 5X a una concentración final de 1X. Etiquetar el tubo con &quot;T&quot; para &quot;lisado total de crudo&quot;. </li><li> Incubar la muestra &quot;T&quot; a 100 ºC durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas por completo. </li><li> Mientras tanto, tomar la segunda alícuota de 25 l y centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos. Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento pequeña, y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiqueta este nuevo tubo &quot;S&quot; para &quot;fracción soluble&quot;. </li><li> Para los BEHI pequeña pellet izquierdand en el paso anterior, se añaden 25 l de tampón de lisis y vórtice para resuspender. Etiquetar este tubo &quot;C&quot; de &quot;fracción de sedimento&quot;. </li><li> Añadir 6 tampón de muestra l de 5X SDS a los tubos y &quot;S&quot; &quot;P&quot; y se incuba a 100 ºC como se describe anteriormente. Nota: Si las muestras TSP no serán utilizados ese día para analizar la expresión, pueden ser congeladas a -20 ° C hasta que se necesite. Una vez descongelado, se deben volvieron a incubar a 100 ºC, como se describió anteriormente, inmediatamente antes de la carga en un gel de SDS-PAGE estándar 12% y / o 15%. </li></ol></li><li> Si bien el análisis se lleva a cabo TSP, centrifugar los restantes 550 l de lisado bruto total (o la totalidad de los 600 l de lisado bruto total si el análisis TSP no se lleva a cabo) a 10.000 x g durante 10 minutos. Recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. Este es el lisado soluble que se utilizará para la purificación. </li></ol></li><li> mezcla lisado. <ol><li> Llevar a cabo la lisis tal como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2 anteriores. </li><li> Mezclar 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad α deseado con 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad β deseado. Incubar a 37 ºC con lenta agitación durante 30 min. Nota: Puede que sea necesario para optimizar el tiempo de incubación para lograr la máxima asamblea durante la mezcla lisado (ver Discusión). El tiempo y la temperatura que se presenta aquí son óptimas para las proteínas recombinantes en este estudio y se determinaron en otro lugar 18. </li><li> Centrifugar el lisado de mezclado a 10.000 x g durante 10 min para separar el material soluble del sedimento insoluble. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice este lisado soluble mixto para la purificación de proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Purificación de la proteína a través de inmovilizada Cobalt Affinity Resin(ICAR). <ol><li> Equilibrar la resina. <ol><li> A fondo resuspender la resina invirtiendo la botella y la transferencia de 50 l de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 700 xg durante 2 min a la resina de pellets. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. Nota: Llevamos a cabo la aspiración de la pipeta usando un azul punta de pipeta de 1 ml para eliminar la mayor parte del líquido. Una punta de 2 l blanco se utiliza para el control fino de la eliminación del sobrenadante restante, dejando una capa muy delgada de líquido de los granos. </li><li> Añadir 1 ml de tampón A. Mezclar suavemente para resuspender la resina y se centrifuga a 700 xg durante 2 min para sedimentar la resina. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y repetir este paso de lavado una vez más. </li></ol></li><li> Aplicar lisado soluble obtenido anteriormente en la sección 2.1 o 2.2 a la resina equilibrada. Incubar el tubo con una rotación suave a 4 ° C durante 60 min. Se centrifuga el tubo a 700 × g &lt;/ Em&gt; durante 5 min y con cuidado aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavar la resina de la siguiente manera para eliminar las proteínas unidas de forma no específica. <ol><li> Resuspender resina con 1 ml de tampón A y se incuban con agitación suave a 4 ° C durante 10 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más. </li><li> Resuspender resina con 1 ml de Tampón B (Tampón A con imidazol 5 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más. </li><li> Resuspender resina con 1 ml de tampón C (tampón A con imidazol 10 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. </li></ol></li><li> Eluir la proteína mediante la adición de 400 l de tampón E (tampón A con imidazol 200 mM) to la resina. Incubar con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar a 700 xg durante 5 min. </li><li> Transferir el sobrenadante que contiene proteína purificada a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Desalar la proteína purificada por centrifugación de serie de la siguiente manera. <ol><li> Para 400 l de proteína purificada, añadir 100 l de tampón A (esto reduce la concentración de imidazol de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml filtros de ultracentrifugación con un 10 kDa de peso molecular de corte. Centrifugar a 14.000 × g durante 5 min. </li><li> Desechar el filtrado y añadir 400 l de tampón A para diluir el retenido y se centrifuga de nuevo. Continuar los ciclos de centrifugación / dilución hasta la concentración de imidazol cae por debajo de 4 mm. Como un ejemplo, si cada centrifugación concentra 500 l hasta ~ 70 l (o aproximadamente 7 veces), a continuación, dos ciclos reducirán el 160 mM a partir de concentración de imidazol (7 × 7 = 49 veces) a aproxoximately 3,3 mM. </li><li> Medir la concentración de proteína de la muestra desalada usando el ensayo BCA 21. Se requiere desalación para reducir los niveles de imidazol por debajo del límite de tolerancia para el ensayo BCA, como se describe en las instrucciones del fabricante: Nota. Nuestro laboratorio prefiere el ensayo BCA porque es sensible, tiene un gran rango dinámico, y exhibe una variación mucho menor de proteína a proteína. Sin embargo, otros métodos para determinar la concentración de proteína pueden ser sustituidos por el ensayo de BCA. La clave es ser consciente de las ventajas y limitaciones de cada método. </li></ol></li><li> Añadir tampón de muestra nativo 5X a una concentración final de 1X y proceder a la electroforesis. Alternativamente, las muestras almacenadas a -20 ° C para su posterior análisis. </li></ol> 4. desnaturalizante en gel de poliacrilamida electroforesis (PAGE). Precaución: no polimerizado acrilamida es una neurotoxina. Use gea de protección apropiador. <ol><li> Preparar el gel no desnaturalizante PÁGINA como sigue. <ol><li> Preparar el casete de gel para moldear utilizando placas de vidrio limpias y emitan soporte. Coloque fabricante de gradiente en la parte superior de un pequeño agitador magnético y se colocará un pequeño imán en cada cámara. </li><li> El uso de 40% (w / v) de acrilamida y 2% (w / v) de soluciones madre bisacrilamida, preparar 5% y 10% (w / v) Las soluciones de gel de acrilamida en un tampón de la solución nativa. Asegúrese de que la proporción de acrilamida total bisacrilamida es 37,5: 1. Se enfría en hielo antes de verter. Nota: El sistema PÁGINA desnaturalizante se utiliza aquí es esencialmente idéntico al sistema SDS-PAGE de Laemmli, con SDS omitió 22. </li><li> Añadir amonio persulfato (de un 10% (w v) solución / preparada en agua) a las soluciones de acrilamida para iniciar la polimerización. La concentración final de amonio persulfato es 0,1% (w / v). </li><li> Vierta las soluciones de acrilamida en las dos cámaras del fabricante de gradiente. Con el tubo de salida b insertadantre las placas de la casete de gel, activar el agitador magnético y se abren las válvulas fabricante de gradiente. Verter la 5 - gel con gradiente desnaturalizante al 10%. </li><li> Una vez vertida, superponer el gel con una capa delgada de isopropanol y permitir que el gel se polimerice durante 30 min. Durante este tiempo, preparar la solución de gel de acrilamida al 5% en tampón fresco resolver nativo. Después de la puesta de gel, vierta el isopropanol y enjuague la parte superior del gel con agua desionizada de una botella con atomizador. </li><li> A la solución de gel de 5% preparada anteriormente, añadir amonio persulfato (exactamente como se describe en 4.1.3) y se vierte en la parte superior del gel polimerizado hasta placas de vidrio están llenos. Inserto de peine gel. Permitir que el gel superpuesto polimerizar durante 30 minutos adicionales. </li><li> Una vez gel se polimeriza, montar casete de gel en el aparato de electroforesis. Como alternativa, el gel almacenar a 4 ° C, envueltas en toallas de papel humedecido y una envoltura de plástico hasta que esté listo para su uso. </li></ol></li><li> Una vez que no desnaturalizante en gel PAGE se ensambla en electrophoresis aparato, llene el tanque con tampón de procesamiento 1X nativa preparada fresca de un tampón 10X ejecución nativa de valores. </li><li> Carga de 10 g de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, en cada pocillo utilizando una jeringa de vidrio. </li><li> Carga 2 l de estándar de alto peso molecular nativo de proteína (diluido en tampón de ejecución nativo 1X) en uno de los pocillos. </li><li> gel de funcionar a 55 V y 4 ºC hasta que el frente del colorante se escurre el gel (aproximadamente 4 - 4,5 horas). </li><li> Además del gel no desnaturalizante, analizar alícuotas de la proteína purificada por la norma SDS-PAGE 22. <ol><li> Mezclar alícuotas (10 g) de las muestras de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, con tampón 5X de muestra de SDS a una concentración final de 1X. </li><li> Incubar a 100 ºC durante 5 min y cargar en estándar 12% y / o 15% en geles de SDS-PAGE 22. </li><li> Correr a 80 V durante 20 min y luego a 120 V hasta que el frente de colorante se sale de la gel (esto es aproximadamente un complementoitional 75 min para un gel 12%, y 120 min para un gel 15%). </li></ol></li></ol> Actividad 5. Visualización y tinción de proteínas. <ol><li> Tras la electroforesis, las placas de vidrio separadas cuidadosamente y transferir el gel no desnaturalizante a una bandeja de gel que contiene 50 ml de agua desionizada. Enjuague gel con agitación suave durante 5 minutos. Desechar el agua y repetir este paso de lavado tres veces. </li><li> Realizar ensayo de recubrimiento de sustrato de la siguiente manera. <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de revelado que contiene el sustrato de péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC y se extendió uniformemente sobre el gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min. Nota: una varilla de vidrio o un liberador de gel (pequeña cuña de plástico utilizado para placas de vidrio separadas) se pueden utilizar para extender el líquido sobre el gel. </li><li> transferir cuidadosamente el gel en el transiluminador UV del sistema de imágenes de gel y observar la fluorescencia debido al sustrato péptido escindido. imagen de registro. Transferir cuidadosamente los ba gelck a la bandeja de gel. </li><li> Enjuague el gel dos veces con 50 ml de agua desionizada durante 5 minutos con agitación suave. </li><li> Tinción del gel con 10 ml de un reactivo de tinción de Coomassie coloidal durante 60 minutos con agitación suave. destain de gel con 50 ml de agua hasta que el fondo se vuelve claro. Esta etapa de tinción se aplica a los geles de SDS-PAGE estándar también. </li></ol></li></ol>

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R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Se demuestra el beneficio de un enfoque combinado para analizar el montaje del proteosoma por nondenaturing PAGE utilizando proteasomas arqueas recombinantes. El método usual de 9,11 coexpresión bacteriana de subunidades del proteasoma permite el análisis rápido, pero puede no revelar montaje intermedios clave. Se aconseja la combinación de co-expresión con lisado de mezcla para desarrollar una visión más amplia de montaje de eventos. La ventaja de este enfoque combinado e...

Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas 1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el 2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares 4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) 5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) 6. El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß 5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas 9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α 7 β 7) dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β 7 7 7 β α 7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas. El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos 14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma 9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración 3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta 19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades. Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomas se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Ellos proporcionan la principal vía de degradación de proteínas intracelulares en las células eucariotas, aunque su montaje no se conoce completamente. Todos los proteasomas contienen una partícula estructuralmente conservadas núcleo (CP), o proteasoma 20S, que contiene dos anillos de subunidades beta heptameric emparedadas entre dos anillos α subunidad heptameric. Archaeal proteasomas 20S son de composición más simple en comparación con sus homólogos eucariotas, sin embargo, que ambos comparten un mecanismo de montaje común. En consecuencia, arqueas proteasomas 20S siguen siendo modelos importantes para el montaje del proteasoma eucariota. En concreto, la expresión recombinante de 20S arqueas proteasomas junto con electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) ha dado muchas pistas importantes sobre la biogénesis del proteasoma. A continuación, se discute un medio para mejorar la estrategia habitual de la co-expresión de α del proteasoma arqueas y las subunidades ß antes de nondenaturiPÁGINA ng. Se demuestra que a pesar de la rápida y eficiente, un enfoque coexpresión solo puede faltar montaje intermedios clave. En el caso de la proteasoma, la coexpresión no puede permitir la detección de la media-proteasoma, una que contiene una α-anillo completo intermedia y una β-anillo completo. Sin embargo, este intermedio se detecta fácilmente mediante la mezcla de lisado. Sugerimos que la combinación de co-expresión con mezcla lisado se obtiene un enfoque que es más profundo en el análisis de montaje, sin embargo, sigue siendo no intensiva de trabajo. Este enfoque puede ser útil para el estudio de otros complejos multiproteicos recombinantes.

El montaje del proteasoma (Figura 1) comienza cuando subunidades se combinan para formar anillos 9. Esto se puede ilustrar cuando subunidades alfa de la archaeon Methanococcus maripaludis S2 se expresan en E. coli como C-terminal de hexahistidina marcado (marcado con His) derivados (Tabla 1). Cuando el α-su proteína recombinante se purificó por ICAR y se analizó por desnaturalizante PAGE, se observaron dos bandas (Figura 2A, carril 1). H...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis.

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K vistas.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis. 

Video: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biología

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

Intercambio específico de residuos de prolina por análogos de prolina en proteínas fluorescentes: cómo la "cirugía molecular" de la columna vertebral afecta el plegamiento y la estabilidad

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Bioingeniería

The Proteasome Structure

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no longer needed. In this pathway, the protein that needs to be eliminated undergoes a process called ubiquitination, where a chain of ubiquitin molecules is attached to the 48th lysine residue of the target protein. This ubiquitin modification helps the proteasome distinguish between a target protein and a healthy protein.
The proteasome is an ATP-driven, large multi-subunit protease (26S) found in the nucleus and cytoplasm of all eukaryotes. The 26S proteasome comprises a central hollow cylindrical core (the 20S) and ring-shaped protein caps (19S). The 20S core particle is barrel-shaped, containing stacked rings with proteolytic active sites lined inside. The 19S caps act as gatekeepers and regulatory units of the proteasome. They are present at one or both ends of the core.
Caps have ubiquitin receptors, ubiquitin hydrolase, and unfoldase, each with a unique function. The ubiquitin receptor recognizes and allows ubiquitin-tagged proteins into the core, the hydrolase deubiquitinase cleaves ubiquitin from the substrate, and the unfoldase protein unfolds target proteins as they enter the protein core.
The hexameric unfoldases create a ring structure in the proteasome cap and belong to a large class of AAA proteins. Their mechanistic action is similar to other ATP-dependent helicases that cause DNA unwinding. The ATP-bound unfoldase ring binds a folded target protein held in place by its ubiquitin tag at the proteasomal cap. Next, a conformational change, driven by ATP hydrolysis, pulls the target protein substrate into the 20S core and strains the ring structure. As a result, when a protein is subjected to pulling forces, it can undergo two possible outcomes&#8212; it may either undergo partial unfolding and enter the cylindrical core, or it can retain its structure while partially retracting.
Highly stable substrates generally require hundreds of cycles of ATP hydrolysis before being pulled through the AAA ring. Once de-ubiquitylated and unfolded, the target protein is exposed to proteases inside the proteasomal core for digestion. In contrast to free cellular proteases, which quickly dissociate after their action on the target protein, the proteasome core holds the target protein until it is fully digested into smaller peptides. These small peptides are then released into the cytosol for further processing.&#160;

La estructura del proteasoma

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no ...