Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK

1. Espressione batterica. Nota: plasmidi di espressione utilizzati in questo studio sono descritti nella Tabella 1. Soluzioni, media e tamponi utilizzati in questo studio sono descritti nella tabella 2. La clonazione di geni proteasoma subunità archeali e la generazione di plasmidi di espressione sono descritte altrove 18,20. In breve, i plasmidi per coexpression ricombinante di subunità impiegano una strategia operone bicistronico che aiuta a ottenere livelli di espressione comparabili di singole subunità 18,20. I parametri di espressione elencati di seguito sono stati empiricamente determinato per essere ottimale per le subunità del proteasoma in questo studio. Potrebbe essere necessario ottimizzare espressione per altri mutanti proteasoma, per proteasomi da altre specie archeali, o per altri complessi di proteine ​​ricombinanti (vedi la discussione). <ol><li> Trasforma plasmide di espressione di interesse in chimicamente competente E. coli BL21 (DE3) cellule. </li><li> Aggiungere 1 - 2 microlitri di plasmide (tipicamente 50 - 100 ng) ad una aliquota di cellule DE3 che sono stati appena scongelati su ghiaccio, e continuano ad incubare su ghiaccio per 20 min. </li><li> shock termico le cellule a 42 ° C per 45 s e tornare tubo di ghiaccio per 2 minuti aggiuntivi. </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno LB e incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per 1 h. </li><li> Distribuire 100 - 200 ml di miscela trasformazione su LB-kan piastre (piastre contenenti mezzi LB solidi, integrati con kanamicina (tutti plasmidi utilizzati in questo studio di resistenza a questo antibiotico encode)). Incubare le piastre a 37 ° C O / N. </li><li> La mattina dopo, inoculare una singola colonia dalla piastra LB-kan in 3 ml di liquido mezzi LB-kan in un tubo di vetro cultura. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 2,5 - 3 h, o fino a quando si osserva torbidità. </li><li> Misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) in uno spettrofotometro. Diluire il culto delle celluleure con una quantità appropriata di mezzi LB-kan preriscaldata ad una OD 600 di 0,4 in un volume finale di 6 mL. Riprendere agitazione a 37 ° C per 40 min. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina nelle colture liquide aggiungendo IPTG da una soluzione madre ad una concentrazione finale di 1 mM. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 6-7 ore. </li><li> Raccolto colture di cellule batteriche nella loro interezza in provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di una cultura in provetta. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere altri 1,5 ml di una stessa cultura al pellet. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Ripetere il passaggio 1.11 fino a quando l&#39;intera coltura è raccolta nella provetta. </li><li> Conservare il pellet indotti a -80 ° C fino lisi. </li></ol> 2. batterica Lisi e lisato di miscelazione. Nota: </strong&gt; Per i campioni studiati tramite coexpression, seguire la sezione 2.1 (e le sue sottosezioni). Per i campioni che richiedono lisato di miscelazione, seguire la sezione 2.2 (e le sue sottosezioni). L&#39;analisi TSP (Total, solubile, pellet) che è incluso nel protocollo è utile per ottimizzare l&#39;espressione della proteina che può aiutare a garantire che circa la stessa quantità di alfa e beta subunità sono unite durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Fornisce inoltre un controllo importante, se non sono come previsto risultati a valle (cioè verifica che la proteina era espresso e solubile). Così, si consiglia vivamente compresa l&#39;analisi TSP inizialmente. Una volta che un protocollo ottimale è stato raggiunto per una particolare combinazione subunità, analisi TSP non è richiesto rigorosamente è per questo che è descritto come optional di seguito. <ol><li> Lisi delle cellule batteriche e la preparazione di frazioni solubili. <ol><li> Scongelare il pellet cellulare indotta in ghiaccio per 5 min. Risospendere il pellet in 600 ml di tampone di lisi. </li><li> IncUbate la sospensione a 30 ° C con agitazione (150 rpm) per 30 min per generare lisato grezzo totale. Nota: Il passo successivo e la sottosezione che segue sono opzionali. </li><li> Rimuovere due aliquote 25 microlitri dal lisato grezzo totale in provette da microcentrifuga da 1,5 ml separati ed effettuare analisi TSP come segue. <ol><li> Per una delle due aliquote 25 microlitri, aggiungere tampone campione SDS 5X ad una concentrazione finale di 1X. Etichettare la provetta con &quot;T&quot; per &quot;lisato grezzo totale&quot;. </li><li> Incubare il campione &quot;T&quot; a 100 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente. </li><li> Nel frattempo, prendere la seconda aliquota 25 microlitri e centrifugare è a 10.000 g per 10 min. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare la piccola pallina, e trasferirlo ad un nuovo 1,5 ml provetta. Etichettare questo nuovo tubo &quot;S&quot; per &quot;frazione solubile&quot;. </li><li> Per i behi piccola pallina di sinistraND nel passaggio precedente, aggiungere 25 ml di tampone di lisi e vortex per risospendere. Etichettare questo tubo &quot;P&quot; per &quot;frazione pellet&quot;. </li><li> Aggiungere 6 tampone campione ml di 5X SDS ai tubi e &quot;S&quot; &quot;P&quot; e incubare a 100 ° C, come descritto sopra. Nota: se non saranno utilizzati i campioni TSP quel giorno per analizzare l&#39;espressione, possono essere congelati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Una volta scongelate, devono essere reincubate a 100 ° C, come descritto sopra, immediatamente prima di essere caricati su un gel SDS-PAGE standard di 12% e / o del 15%. </li></ol></li><li> Mentre l&#39;analisi TSP viene effettuata, centrifugare il restante 550 ml di lisato grezzo totale (o l&#39;intero 600 ml di lisato grezzo totale se l&#39;analisi TSP non viene effettuata) a 10.000 g per 10 min. Raccogliere il surnatante in una fresca 1,5 ml provetta. Questo è il lisato solubile che verrà utilizzato per la purificazione. </li></ol></li><li> Lisato miscelazione. <ol><li> Effettuare lisi come descritto ai punti 2.1.1 e 2.1.2 di cui sopra. </li><li> Mescolare 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità α desiderato con 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità β desiderato. Incubare a 37 ° C con lenta agitazione per 30 min. Nota: Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione per ottenere il massimo assemblaggio durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Il tempo e la temperatura qui presentati sono ottimali per le proteine ricombinanti in questo studio e sono stati determinati altrove 18. </li><li> Centrifugare il lisato mista a 10.000 g per 10 minuti per separare materiale solubile da pellet insolubili. Trasferire il surnatante in un nuovo 1,5 ml provetta. Utilizzare questo lisato solubile mista per la purificazione della proteina. </li></ol></li></ol> 3. purificazione della proteina tramite Immobilized Cobalt Affinity Resina(ICAR). <ol><li> Equilibrare la resina. <ol><li> Accuratamente risospendere la resina capovolgendo il flacone e trasferire 50 ml di liquame di una provetta da microcentrifuga da 1,5. Centrifugare a 700 g per 2 minuti per resina pellet. Con attenzione aspirare il surnatante. Nota: Effettuiamo aspirazione pipetta utilizzando una punta blu 1 ml pipetta per rimuovere la massa del liquido. Un bianco tip 2 microlitri viene utilizzato per la regolazione fine della rimozione del surnatante rimanente, lasciando uno strato molto sottile di liquido che copre le perline. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone A. Mescolare delicatamente per risospendere resina e centrifugare a 700 g per 2 minuti per far sedimentare resina. Con attenzione aspirare il surnatante e ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. </li></ol></li><li> Applicare lisato solubile ottenuto in precedenza nella sezione 2.1 o 2.2 alla resina equilibrata. Incubare la provetta con rotazione dolce a 4 ° C per 60 min. Centrifugare la provetta a 700 × g &lt;/ Em&gt; per 5 minuti e con attenzione aspirare il surnatante. </li><li> Lavare la resina come segue per rimuovere le proteine ​​non specifico legato. <ol><li> resina risospendere con 1 ml di tampone A e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 10 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone B (tampone A con 5 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone C (tampone A con 10 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. </li></ol></li><li> Eluire la proteina con l&#39;aggiunta di 400 ml di tampone E (tampone A con 200 mm imidazolo) to la resina. Incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare a 700 g per 5 min. </li><li> Trasferire il surnatante contenente proteina purificata in un 1,5 mL provetta da centrifuga. </li><li> Dissalare la proteina purificata mediante centrifugazione seriale come segue. <ol><li> Per 400 ml di proteina purificata, aggiungere 100 microlitri tampone A (questo riduce la concentrazione Imidazole da 200 mm a 160 mm). Applicare proteina purificata a 0,5 ml filtri ultracentrifugo con un 10 peso molecolare kDa cut-off. Centrifugare a 14.000 g per 5 min. </li><li> Eliminare il filtrato e aggiungere 400 microlitri tampone A per diluire il retentato e centrifugare di nuovo. Continuare i cicli di centrifugazione / diluizione fino concentrazione imidazolo scende al di sotto di 4 mm. Ad esempio, se ogni centrifugazione concentra 500 microlitri fino a ~ 70 microlitri (o circa 7 volte), poi due cicli ridurrà l&#39;avvio 160 mM imidazolo concentrazione (7 x 7 = 49 volte) per approximately 3,3 mm. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine del campione dissalato utilizzando il saggio BCA 21. Nota: Dissalazione è necessaria per ridurre i livelli imidazolici di sotto del limite di tolleranza per il saggio BCA, come descritto nelle istruzioni del produttore. Il nostro laboratorio preferisce il saggio BCA perché è sensibile, ha un ampio range dinamico, e presenta molto meno variazione proteina-to-proteine. Tuttavia, altri metodi per determinare la concentrazione di proteine ​​possono essere sostituiti per il saggio BCA. La chiave è essere consapevoli dei vantaggi e dei limiti di ciascun metodo. </li></ol></li><li> Aggiungere 5X tampone campione nativo ad una concentrazione finale di 1X e procedere ad elettroforesi. In alternativa, conservare i campioni a -20 ° C per una successiva analisi. </li></ol> 4. nondenaturing SDS-PAGE (PAG). Attenzione: secondo le normative vigenti acrilamide è una neurotossina. Indossare adeguata protezione gear. <ol><li> Preparare il gel PAGE nondenaturing come segue. <ol><li> Preparare la cassetta del gel per la fusione con lastre di vetro puliti e la colata stand. Mettere produttore di pendenza sulla cima di un piccolo agitatore magnetico e posizionare una piccola ancoretta in ciascuna camera. </li><li> Utilizzando 40% (w / v) acrilammide e 2% (w / v) soluzioni stock bisacrylamide, preparano 5% e il 10% (w / v) soluzioni gel di acrilammide in un buffer risoluzione nativa. Assicurarsi che il rapporto di acrilamide totale bisacrylamide è 37,5: 1. Freddo sul ghiaccio prima di versare. Nota: Il sistema nondenaturing PAGE usato qui è sostanzialmente identico al sistema SDS-PAGE Laemmli, con SDS omessa 22. </li><li> Aggiungere persolfato di ammonio (da 10% (w / v) soluzione madre preparata in acqua) alle soluzioni di acrilammide per iniziare la polimerizzazione. concentrazione finale di ammonio persolfato è 0,1% (w / v). </li><li> Versare le soluzioni di acrilamide nelle due camere del creatore di gradiente. Con il tubo di uscita b inseritara le piastre della cassetta gel, attivare l&#39;agitatore magnetico e si aprono le valvole gradiente creatore. Versare il 5 - gel non denaturante pendenza del 10%. </li><li> Una volta versato, sovrapporre il gel con un sottile strato di isopropanolo e consentire il gel polimerizzare per 30 min. Durante questo tempo, preparare la soluzione di gel di acrilammide fresco 5% in tampone risoluzione nativa. Dopo i set di gel, travasare isopropanolo e sciacquare la parte superiore del gel con acqua deionizzata da una spruzzetta. </li><li> Per la soluzione di gel 5% preparata sopra, aggiungere ammonio persolfato (esattamente come descritto in 4.1.3) e versare sulla superficie del gel polimerizzato fino lastre di vetro sono pieni. Inserto in gel pettine. Lasciare il gel sovrapposto polimerizzare per altri 30 min. </li><li> Una volta che il gel è polimerizzato, assemblare cassette gel in apparato di elettroforesi. In alternativa, conservare il gel a 4 ° C, avvolti in tovaglioli di carta inumidito e l&#39;involucro di plastica fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Una volta nondenaturing gel PAGE è assemblato in eletApparecchio trophoresis, riempire il serbatoio con 1X tampone esecuzione nativa preparato fresco da un buffer in esecuzione nativa 10X magazzino. </li><li> Carico 10 ug di proteina purificata, ottenuto alla fine della sezione 3, in ogni pozzetto usando una siringa di vetro. </li><li> Carico 2 ml di alto livello peso molecolare nativa delle proteine ​​(diluito in 1X buffer di esecuzione nativa) in uno dei pozzi. </li><li> Eseguire gel a 55 V e 4 ° C fino a quando il fronte del colorante scappa il gel (circa 4-4,5 ore). </li><li> In aggiunta al gel non denaturante, analizzare aliquote della proteina purificata dalla norma SDS-PAGE 22. <ol><li> Mescolare aliquote (10 ug) dei campioni di proteine ​​purificate, ottenuti alla fine della sezione 3, con tampone 5X SDS-campione ad una concentrazione finale di 1X. </li><li> Incubare a 100 ° C per 5 minuti e caricare su standard di 12% e / o del 15% gel SDS-PAGE 22. </li><li> Eseguito a 80V per 20 minuti e poi a 120 V fino a quando il fronte del colorante corre il gel (questo è approssimativamente un addtransi- 75 min per un gel al 12%, e 120 min per un gel 15%). </li></ol></li></ol> 5. Visualizing attività e proteine ​​di colorazione. <ol><li> Dopo elettroforesi, lastre di vetro accuratamente separati e trasferire il gel non denaturante ad un vassoio gel contenente 50 mL di acqua deionizzata. Risciacquare gel con dolce dondolio per 5 min. Eliminare l&#39;acqua e ripetere l&#39;operazione di lavaggio per tre volte. </li><li> Eseguire test overlay substrato come segue. <ol><li> Aggiungere 1 mL di sviluppare tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC e diffondere uniformemente su gel. Incubare a 37 ° C per 30 min. Nota: Una bacchetta di vetro o un releaser gel (piccolo cuneo di plastica usata per lastre di vetro separate) possono essere utilizzati per diffondere il liquido sul gel. </li><li> Trasferire accuratamente il gel sul transilluminatore UV del gel sistema di imaging e osservare la fluorescenza a causa del substrato peptidico spaccati. immagine Record. trasferire accuratamente l&#39;ba gelck al vassoio gel. </li><li> Lavare il gel due volte con 50 ml di acqua deionizzata per 5 minuti con dolce dondolio. </li><li> Colorare il gel con 10 ml di una colloidale reattivo Coomassie macchia per 60 minuti con il dolce dondolio. Gel Decolorare con 50 ml di acqua fino a sfondo diventa chiara. Questa fase di colorazione applica ai gel SDS-PAGE standard così. </li></ol></li></ol>

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<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio. Il vantaggio di questo approccio combinato è che pur richiedendo espressione separata del α e ß subunità per lisato miscelazione, è ancora relativamente lavoro-friendly. I risultati possono anche essere semiquantitativa se si assicura i livelli di espressione comparabili e coerenti delle singole proteine. A tal fine, si consiglia di effettuare la consueta ottimizzazione di espressione della proteina ricombinante per determinare le condizioni che consentano livelli comparabili di proteine ​​espresse prima di lisato di miscelazione. L&#39;ottimizzazione può includere o meno induzione time, la temperatura di induzione, densità ottica a induzione, batterica ceppo espressione, e così via, fino a ottenimento di livelli desiderati di proteina solubile. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano versioni WT e mutanti di una proteina perché a volte il mutante può presentare livelli di espressione comparabili, ma è diminuito solubilità. Abbiamo inoltre sottolineare l&#39;importanza di determinare le concentrazioni di proteine ​​dei campioni ICAR-purificata prima di caricamento della pagina nondenaturing. Anche con ottimizzazione espressione in posto, e con la migliore cura di assicurare che i campioni paralleli vengono elaborati attraverso i passaggi di purificazione nello stesso modo, la varianza può ancora essere introdotto inavvertitamente. Una misura della concentrazione assicura che la stessa quantità di proteina totale viene caricato per pozzetto. Questo rende i confronti di corsia a corsia di intensità di banda per un determinato la migrazione delle specie più significativo. Se i livelli comparabili e coerenti di espressione della proteina non possono essere raggiunti per LysaTE miscelazione, si può sempre purificare tutti i componenti in anticipo e portare a termine la miscelazione esperimenti con proteine ​​pure. Questo ha il vantaggio di consentire determinazioni delle proteine ​​più precisi e quindi rende quantitativa approccio. Tuttavia, l&#39;inconveniente di purificazione pieno è che il processo diventa notevolmente più manodopera, che può impedire una rapida analisi di mutanti multipli simultaneamente 18. Un avvertimento finale degno di nota è che a volte separano espressione di α e subunità beta potrebbero non essere possibile. Ciò può verificarsi se una mutazione provoca una subunità insolubile in E. coli quando espresso da sola, ma permette solubilità per essere recuperato quando il mutante è espressa con il partner legante. Se ciò si verifica, si limiterà analisi di coespressione soltanto. Tuttavia, questo è un avvertimento che possono sorgere durante l&#39;espressione della proteina ricombinante in generale, e non è specifico per subunità del proteasoma archeali 24,25. Abbiamo scelto di GeneRate derivati ​​his-tag delle nostre proteine ​​del proteasoma a causa della facilità di purificazione e la convenienza della resina ICAR. Altre categorie epitopi sono possibili, compresi quelli per la purificazione a base di anticorpi, e abbiamo espresso con successo e purificati versioni Flag-tag dei nostri subunità del proteasoma (non mostrato). Tuttavia, se è richiesta la purificazione all&#39;omogeneità (o aumentando la scala di produzione), le versioni suo-targhette forniscono i mezzi più veloci e più conveniente di farlo. E &#39;un dato di fatto che i risultati ottenuti con le proteine ricombinanti, siano essi archeali o proteine eucariotiche prodotte nei batteri, guadagnerà ulteriore significato quando è seguito con osservazioni in vivo. Tuttavia, un approccio in vivo può non essere sempre immediatamente accessibili sperimentalmente. Questo è particolarmente vero quando il soggetto di studio è un grande, multisubunit complesso come il proteasoma. proteina ricombinante avvicina fornire un importante punto di lancio per Future esperimenti. Nel caso del proteasoma, l&#39;associazione di produzione archeali proteasoma ricombinante con PAGINA nondenaturing continuerà ad essere molto efficace nel chiarire le caratteristiche fondamentali di assemblaggio proteasoma, che sono condivisi tra le specie archeali e eucarioti 9,11,12,18. Tale approccio può essere utile per studiare l&#39;assemblaggio di altri grandi complessi multiproteici pure. Recentemente, abbiamo usato questa strategia per dimostrare che proteasomi archeali possono assemblare con più di un percorso, e che alfa-ring non sono gli intermedi obbligati durante il montaggio che sono stati pensati per essere 18. Resta da stabilire se lo stesso vale per proteasomi eucariotiche.

Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità da una particella regolamentazione 19S (RP) 6. Il proteasoma 20S è un grande proteasi compartimenti stagni. La sua struttura quaternaria è assolutamente conservata in tutti i domini della vita e consiste in una pila di quattro anelli di sette membri contenente due tipi di subunità strutturalmente correlati, α; e ß 5,7,8. Negli eucarioti, i due anelli esterni sono ciascuna costituite da sette subunità alfa distinti e due anelli interni sono ciascuna costituite da sette subunità beta distinti; attività proteolitica risiede entro tre delle subunità beta. Per contro, gli anelli di CP archaea e batteri sono generalmente costituiti da un solo tipo di α e un tipo di subunità β. Proteasomi archaeal hanno fornito un sistema importante modello per lo studio di montaggio proteasoma sia per la loro semplicità compositiva e la loro condivisione di un meccanismo di montaggio comune con le loro controparti eucariotiche 9-13. In breve, subunità alfa assemblano in anelli alfa prima, che servono da impalcatura su cui beta subunità assemblare. I risultanti mezze proteasomi (α β 7 7) dimerizzano, dando luogo ad assemblare completamente CP (α β 7 7 β α 7 7). Durante dimerizzazione, i propeptidi presenti su subunità betasono autocatalytically rimossi, esponendo i catalitici threonines N-terminale. L&#39;uso dei proteasomi archeali per modellare il montaggio prende frequentemente vantaggio della produzione di proteine ricombinanti proteasoma archeali in Escherichia coli. Questo è un approccio interessante perché consente subunità essere prodotte in varie combinazioni, sia come WT e versioni mutanti, in un organismo ospite che non produce i propri proteasomi. Monitorare l&#39;assemblaggio di complessi multi-proteina richiede biochimicamente un qualche tipo di metodo di frazionamento che separa i complessi completamente assemblati da intermedi di assemblaggio e precursori. Grazie alla sua capacità di risoluzione superiore, nondenaturing SDS-PAGE (PAGINA) ha dimostrato di essere particolarmente utile nel frazionamento di varie grandi complessi multiproteici 14-17. La combinazione di produzione proteasoma archaeal ricombinante e PAGE nondenaturing è diventato un approccio potente dissecting assemblaggio proteasoma 9,11,12,18. Tuttavia, il metodo usuale con cui questo approccio viene applicato (es. Tramite la coespressione ricombinante di alfa e beta subunità) ha un importante inconveniente. Le reazioni di montaggio sono cooperativa e fortemente dipendente dalla concentrazione 3. Dato che la concentrazione di proteine all&#39;interno delle cellule è molto alta 19, a causa di effetti di volume escluso, reazioni di assemblaggio siano effettuati rapidamente in vivo. Quindi è possibile perdere importanti intermedi di montaggio quando alfa e beta subunità sono coexpressed. Qui, sosteniamo un approccio combinato nello studio di assemblaggio proteasoma usando ricombinanti subunità del proteasoma archeali. In questo approccio, entrambi i metodi di miscelazione coespressione e lisato sono impiegati. Il primo permette per l&#39;analisi rapida di assemblaggio, perché coexpression è meno laborioso. Quest&#39;ultimo dipende espressione separata di alfa e beta subunità, seguita da miscelazione. Anche se questo requires un po &#39;più sforzo che coexpression, è più che compensata dalla capacità di individuare prodotti intermedi che sono mancati durante coexpression. Insieme, questi due metodi in grado di fornire un quadro più completo di montaggio proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine ​​intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l&#39;espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l&#39;analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.

Assemblaggio proteasoma (Figura 1) inizia quando subunità alfa si combinano per anelli di forma 9. Ciò può essere illustrato quando alfa subunità dalla archaeon Methanococcus maripaludis S2 sono espressi in E. coli come C-terminale hexahistidine tag (His-tag) derivati (Tabella 1). Quando la α-la proteina ricombinante è stata purificata dall&#39;ICAR e analizzata mediante nondenaturing PAGE, due bande sono state osservate (Figura 2A, corsia 1). Abbiamo precedentemente dimostrato che questi corrispondono a Squillo unico alfa (SR) e doppio alfa-ring (DR) 18. Il DR è una specie dead-end che non è produttivo per il successivo assemblaggio 9,18. Quando alfa-le sue subunità sono stati coexpressed con subunità beta, che rappresenta il solito metodo con cui il montaggio dei proteasomi archeali ricombinanti viene analizzato, è stata osservata una specie di romanzo la migrazione presso lo stand 670 dimensioni kDaard (Figura 2A, corsia 3). Questa specie è stata proteoliticamente attiva (Figura 2B, corsia 3) e conteneva subunità beta solo completamente maturi (mβ) i cui propeptidi sono stati rimossi (Figura 2C, corsia 3). Questa specie è il CP pienamente maturo. Questo campione conteneva anche alcune specie SR, che è stato previsto perché SR è un assemblaggio noto intermedio, ma nessuna specie DR. La mancanza di DR, quando alfa-lui e subunità beta sono coexpressed suggerisce che il corretto montaggio stava avvenendo abbastanza rapidamente in modo tale che l&#39;incorporazione della subunità beta è stato in grado di outcompete la formazione non produttiva di DR (per un&#39;analisi più dettagliata si veda 18). Per dimostrare la limitazione del metodo coespressione e sostenere l&#39;utilità di un approccio combinato, α-la e subunità beta sono stati espressi separatamente in E. coli. Dopo lisi, le frazioni solubili sono stati miscelati e proteine ​​sono stati purificati dall&#39;ICAR primaanalisi PAGE nondenaturing. Completamente proteasomi funzionali sono stati generati mediante la miscelazione lisato approccio (Figura 2A e 2B, corsia 2), e le specie SR è stato anche osservato come previsto. La ricomparsa della specie DR del lisato campione miscelazione indica che una volta formato, subunità beta sono in grado di smontare reversibilmente esso; Ciò sottolinea la natura vicolo cieco del DR. È interessante notare che una nuova specie è apparso anche nel campione di miscelazione lisato, la migrazione appena sotto la CP (definito &quot;mezzo&quot;). Recentemente, abbiamo dimostrato che questa specie corrisponde alla metà-proteasoma (alfa 7 β 7) 18. Per illustrare questo qui, è stato impiegato un mutante β subunità (R166W). Questa mutazione distrugge interazione anello β-β, che porta alla compromissione dimerizzazione mezza proteasomi 18. Dal momento che le mezze proteasomi sono i precursori immediati per CP, la mutazione R166W dovrebbe portare sia l&#39;accumulo di mezze proteasomi unda diminuzione della formazione di CP. Quando lisato miscelazione con alfa-beta e le sue (R166W) subunità è stata effettuata, sono stati osservati livelli più bassi di CP e aumento dei livelli di specie &quot;metà&quot; (Figura 2A, corsia 4). Questo è coerente con un rapporto precursore prodotto per queste due bande, e conferma l&#39;identità della specie &quot;mezze&quot; come meta-proteasoma. La migrazione leggermente più veloce del mezzo-proteasoma nel campione mutante (corsia 4 contro corsia 2) è probabilmente dovuto alla mutazione R166W alterare il rapporto di massa-a-carica della subunità β. La possibilità di visualizzare meta-proteasoma durante lisato miscelazione è dovuto principalmente a concentrazioni proteiche molto bassi nel lisato rispetto alle concentrazioni elevate di proteine ​​all&#39;interno delle cellule. Concentrazioni inferiori producono meno efficiente assemblaggio (cioè più lenta), che consente intermedi a diventare più popolato e quindi rilevabile. Inoltre l&#39;aspetto del mezzo-proteasoma,<html> un&#39;osservazione ulteriore evidenzia l&#39;efficienza di assemblaggio diminuito durante lisato di miscelazione: subunità beta non trasformati, che mantengono le loro propeptidi, diventano rilevabili (proβ). Dal momento che l&#39;elaborazione propeptide non si verifica fino a quando proteasomi mezzo dimerizzano, l&#39;aspetto del modulo proβ immatura è correlata con il livello di accumulo di mezza proteasoma (confrontare Figura 2C, corsia 3 contro corsia 2 contro corsia 4). Nel caso del mutante R166W, il fallimento trasformazione propeptide durante lisato miscelazione è assoluta, anche se una piccola quantità di CP si forma. Questo perché l&#39;elaborazione propeptide non solo richiede dimerizzazione metà proteasoma, ma anche un corretto formata interfaccia anello β-β 23 che la mutazione R166W non offre. Una narrazione più dettagliata di coexpression contro lisato di miscelazione, in quanto riguarda il montaggio proteasoma ricombinante, può essere trovato qui 18. figura 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Uno schema semplificato di core Particle (CP) Assembly. Le subunità alfa possono assemblare in un unico α-primo anello (SR) che serve come modello per l&#39;inserimento di subunità beta. Questo porta alla generazione del semi-proteasoma intermedia (metà) che dimerizza rapidamente. In concomitanza con dimerizzazione, i propeptidi β subunità (non mostrate) vengono rimossi autocatalytically dando origine alla particella nucleo completamente funzionale (CP). Doppia alfa-ring (DR) possono sorgere da SR e non sono competenti per il montaggio in CP. La loro formazione rappresenta un percorso di montaggio non produttiva (freccia tratteggiata) in contrasto con eventi di assemblaggio produttive (frecce solidi). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54860/54860fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54860 / 54860fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: un approccio combinato per il saggio di montaggio del proteasoma. Coexpression (C) e lisato di miscelazione (L) sono stati impiegati per studiare montaggio di proteasomi ricombinanti dal archaeon M. maripaludis. Le proteine ​​sono stati purificati da Immobilized Cobalt Affinity resina (ICAR). (A, B) proteine purificate (10 mcg) sono stati caricati su-denaturanti non 5 - 10% gel gradiente. Dopo elettroforesi, attività peptidasi stato visualizzato sovrapponendo il gel con una soluzione tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC (B) prima della colorazione del gel con Coomassie colloidale reagente macchia (A). frecce nere indicano le posizioni del nucleo particella 20S assemblati (CP), semi-proteasoma intermedia (metà), α-doppio anello (DR) e α-ring singola (CS). La migrazione di diversi standard di dimensioni molecolari (in kDa) è indicato a destra. (C) </strong&gt; proteine purificate (10 mcg) da un sono stati caricati anche sul 15% gel SDS-PAGE. Dopo l&#39;elettroforesi, gel sono stati colorati con un reagente colloidale Coomassie macchia. La migrazione di α-sua subunità e pienamente matura (mβ) e immaturi (proβ) subunità beta è indicato. La posizione dello standard dimensione molecolare 25 kDa è mostrato a destra. L&#39;asterisco indica un tronco α-suo frammento subunità derivanti dalla proteolisi non specifico durante la lisi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54860/54860fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> plasmidi </td><td> Genotipo </td><td> fonte </td></tr><tr><td> AKB191 </td><td> pET42 PSMA-suo </td><td> Kusmierczyk et al., (2011) </td></tr><tr><td> AKB464 </td><td> pET42 PSMA-suo psmB </td><td> Kusmierczyk et al., (2011) </td></tr><tr><td> AKB946 </td><td> pET42 psmB </td><td> Panfair et al., (2015) </td></tr><tr><td> AKB952 </td><td> pET42 psmB (R166W) </td><td> Panfair et al., (2015) </td></tr></tbody></table> Tabella 1: plasmidi batterici utilizzati in questo studio. PSMA è il gene α subunità archaeal e psmB è il gene β subunità archaeal. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampone A </td><td> 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. </td><td> Buffer B, C ed E, sono derivati ​​di tampone A contenente imidazolo. È utile aggiungere imidazolo da un magazzino 2 M preparato in acqua e conservata al buio. </td></tr><tr><td> buffer di risolvere Native </td><td> 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametiletilendiammina (TEMED) e 0,1% (w / v) di ammonio Perulfate (APS). </td><td> Preparato fresco non più di un&#39;ora prima del gel è da polimerizzare e tenuti in ghiaccio. Nel preparare soluzioni gel di acrilammide in tampone risoluzione nativa, è utile aggiungere il Tris-HCl da uno stock 4X (1,5 M Tris-HCl, pH 8.8). L&#39;APS viene aggiunta immediatamente prima della polimerizzazione. </td></tr><tr><td> buffer di esecuzione nativa 10X magazzino </td><td> 250 mm Tris, 1,92 M glicina, non aggiustare il pH. </td><td></td></tr><tr><td> 5X tampone campione nativo </td><td> 0.5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) glicerolo, tracce di blu di bromofenolo. </td><td> Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. </td></tr><tr><td> 5X SDS-campione del buffer </td><td> 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8, 600 mM ditiotreitolo (DTT), 10% (w / v) di SDS, 50% (v / v) di glicerolo e tracce di blu di bromofenolo. </td><td> Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. </td></tr><tr><td> Lo sviluppo del buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. </td><td> Suc-LLVY-AMC è un substrato peptidico fluorogenico utilizzato per saggiare l&#39;attività del proteasoma. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Soluzioni, Media, e tamponi utilizzati in questo studio.

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.

Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Views.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante. 

Video: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

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Biochimica

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Biologia

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is therefore fundamental for the understanding of cellular processes. However, many protein complexes are dynamic assemblies and are not accessible by conventional structural techniques. Mass spectrometry contributes to the structural investigation of these assemblies, and particularly the combination of various mass spectrometric techniques delivers valuable insights into their structural arrangement.
In this article, we describe the application and combination of two complementary mass spectrometric techniques, namely chemical cross-linking coupled with mass spectrometry and native mass spectrometry. Chemical cross-linking involves the covalent linkage of amino acids in close proximity by using chemical reagents. After digestion with proteases, cross-linked di-peptides are identified by mass spectrometry and protein interactions sites are uncovered. Native mass spectrometry on the other hand is the analysis of intact protein assemblies in the gas phase of a mass spectrometer. It reveals protein stoichiometries as well as protein and ligand interactions. Both techniques therefore deliver complementary information on the structure of protein-ligand assemblies and their combination proved powerful in previous studies.

The architecture of protein complexes is essential for their function. Combining various mass spectrometric techniques proved powerful to study their assembly. We provide protocols for chemical cross-linking and native mass spectrometry and show how these complementary techniques help to elucidate the architecture of multi-subunit protein assemblies.

Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato

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