이 작품은 ARK로, 미국 심장 협회 14GRNT20390154에서 수상에 의해 부분적으로 인디애나 대학교 - 퍼듀 대학교 인디애나 폴리스에서 연구 지원 기금 그랜트 (RSFG)에 의해 부분적으로 지원

1. 세균성 식입니다. 참고 : 본 연구에 사용 된 발현 플라스미드는하기 표 1에 기재되어있다. 본 연구에서 사용 된 용액, 미디어, 버퍼는 표 2에 기재되어있다. 고세균 테아 소단위 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 발생이 다른 18,20 설명한다. 요컨대, 서브 유닛의 재조합 동시 발현을위한 플라스미드는 각각의 서브 유닛 (18, 20)의 비교 발현 수준을 획득하는 데 도움이 bicistronic 오페론 전략을 사용한다. 아래에 나열된 식 매개 변수는이 연구에서 프로 테아 서브 유닛에 대한 최적의 것으로 경험적으로 결정했다. 다른 고세균 종에서, 또는 다른 재조합 단백질 복합체 (토론 참조) 프로 테아를 들어, 다른 프로 테아 돌연변이에 대한 표현을 최적화 할 필요가있다. <ol><li> (화학적으로 유능한 대장균 BL21에 관심의 발현 플라스미드를 변환DE3) 세포. </li><li> 갓 얼음에 해동 된 DE3 세포의 나누어지는로 - (100 NG 일반적으로 50), 20 분 동안 얼음에 품어 계속 플라스미드의 2 μL - 1을 추가합니다. </li><li> 열 충격 45 초 동안 42 ° C에서 세포와 additionl 2 분 동안 얼음에 튜브를 반환합니다. </li><li> LB 배지 1 mL를 넣고 1 시간 동안 (150 rpm으로)을 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> ((카나마이신이 보충 된 LB 고체 배지를 함유하는 플레이트이 항생제 본 연구 인코딩 저항에 사용 된 모든 플라스미드)) 관 LB 플레이트 상에 형질 전환 혼합물의 200 μL - 100 확산. 37 ºC O / N에서 번호판을 품어. </li><li> 다음 날 아침, 유리 문화 튜브에 액체 LB-관 미디어의 3 mL의에 LB-칸 판에서 단일 콜로니를 접종. 약 2.5 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어 - 3 시간, 또는까지 혼탁이 관찰된다. </li><li> 분광 광도계 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도를 측정한다. 셀 숭배를 희석6 ㎖의 최종 부피 0.4의 OD 600 데워진 LB 관 매체 적당량 URE. 40 분 37 ºC에서 진탕 다시 시작합니다. </li><li> 1 mM의 최종 농도 원액에서 IPTG를 첨가하여 액체 배양 물에서 단백질 발현을 유도한다. 7 시간 - 약 6 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어. </li><li> 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 그 전체가 세균 세포 배양을 수확. </li><li> microcentrifuge 관에 문화의 1.5 ML을 추가합니다. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 펠렛에 동일한 문화의 또 다른 1.5 mL를 넣어. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 전체 문화까지 단계를 반복 1.11은 microcentrifuge 관에 수확한다. </li><li> 용해 될 때까지 -80 ° C에서 유도 된 펠렛을 저장합니다. </li></ol> 2. 세균 용해와 해물을 혼합. 노트: </strong&gt; 동시 발현을 통해 연구 샘플의 경우, 2.1 (및 하위 섹션)을 따릅니다. 해물 혼합을 필요로하는 샘플의 경우, 2.2 절 (및 하위 섹션)을 따릅니다. 프로토콜에 포함 된 TSP (총, 가용성, 펠렛) 분석은 혼합 해물 (토론 참조) 중 결합 α와 β 서브 유닛의 대략 동일한 금액을 보장 할 수있는 단백질 발현을 최적화에 유용하다. 또한 다운 스트림 결과가 예상되지 않는 한 경우 (즉,이 단백질이 발현 및 가용성 것을 확인합니다) 중요한 제어 기능을 제공합니다. 따라서, 우리는 매우 초기 TSP 분석을 포함하는 것이 좋습니다. 최적의 프로토콜은 특정 서브 유니트 조합에 대해 달성되면, TSP 분석 엄격 이하 선택적으로 설명하는 이유이다 필요하지 않다. <ol><li> 균체 및 가용성 분획 제제의 용해. <ol><li> 5 분 동안 얼음에 유도 된 세포 펠렛을 해동. 용해 완충액 600 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> Inc의총 조질 용 해물을 생성하기 위해 30 분 동안 (150 RPM)를 진탕하면서 30 ºC의 현탁액 ubate. 참고 : 다음 단계 및 다음 하위 섹션은 선택 사항입니다. </li><li> 별도의 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 총 원유 해물에서 두 25 μL 씩을 제거하고 다음과 같이 TSP 분석을 실시하고 있습니다. <ol><li> 두 25 μL 씩 중 하나, 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 버퍼를 추가한다. &quot;총 원유 해물&quot;에 대한 &quot;T&quot;와 튜브 라벨. </li><li> 5 분 완전히 단백질을 변성하는 100 ºC에서 &quot;T&quot;샘플을 품어. </li><li> 한편, 제 25 μL 나누어지는을 10 분간 10,000 × g에서이를 원심 분리. 조심스럽게 작은 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. &quot;가용 분&quot;에 대한 새로운 관 &quot;S&quot;를 레이블. </li><li> 작은 펠릿 왼쪽 behi에차 이전 단계에서, 재현 탁에 용해 버퍼와 소용돌이의 25 μL를 추가합니다. &quot;펠릿 부분&quot;이 관 &quot;P&quot;를 레이블. </li><li> 은 &quot;S&quot;와 &quot;P&quot;튜브에 6 μL 5 배의 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 상술 한 바와 같이 100 ºC에서 품어. 참고 : TSP 샘플 표현을 분석하는 그 날 사용하지 않을 경우 필요할 때까지, 그들은 -20 ºC에서 동결 할 수있다. 12 % 및 / 또는 15 % 표준 SDS-PAGE 겔에 바로로드되기 전에, 상기 한 바와 같이 일단 해동, 그들은, 100 ºC에서 reincubated해야합니다. </li></ol></li><li> TSP에 분석이 수행되는 동안 원심 총 조질 용 해물의 잔여 550 μL 10 분 동안 10,000 × g에서 (또는 총 조질 용 해물의 전체 600 μL TSP 분석이 수행되지 않은 경우). 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 수집합니다. 이 정제에 사용되는 수용성 분해물이다. </li></ol></li><li> 해물 혼합. <ol><li> 단계 2.1.1 위 2.1.2에 설명 된대로 용해을 수행하십시오. </li><li> 원하는 β 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 사용하여 원하는 α 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 섞는다. 천천히 30 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 주 :이 (논의 참조) 혼합 용 해물 중에 최대 어셈블리를 달성하는 인큐베이션 시간을 최적화하는 것이 필요할 수있다. 시간과 여기에 제시된 온도는이 연구에서 재조합 단백질에 최적이며, 다른 곳에서 (18)를 측정 하였다. </li><li> 원심 분리기 10 분 동안 10,000 × g에서 혼합 해물은 불용성 펠렛에서 용해성 물질을 분리합니다. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 단백질 정제에 대해이 혼합 용해 해물을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 고정화 코발트 친 화성 수지를 통해 3. 단백질 정제(ICAR). <ol><li> 수지 평형. <ol><li> 철저하게 병을 반전 수지를 재현 탁하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 슬러리의 50 μL를 전송합니다. 펠릿 수지 2 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 참고 : 우리는 액체의 대부분을 제거하기 위해 파란색 1 mL를 피펫 팁을 사용하여 피펫 포부를 실시하고 있습니다. 백색 2 μL 팁 비드를 덮는 액체의 매우 얇은 층을 남겨두고 나머지 상층 액 제거의 미세 제어를 위해 사용된다. </li><li> 부드럽게 수지 펠렛 2 분 동안 700 × g에서 수지와 원심 분리기를 재현 탁 1 mL의 버퍼 A. 믹스의 추가합니다. 조심스럽게 뜨는을 대기음이 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li></ol></li><li> 평형화 수지에 2.1 또는 2.2에서 이전에 취득한 가용성 해물을 적용합니다. 60 분 4 ºC에서 부드러운 회전 튜브를 품어. g &lt;700 ×에서 튜브를 원심 분리기/ 5 분 안에&gt; 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 비특이적으로 결합 단백질을 제거하기 위해 다음과 같이 수지를 씻으십시오. <ol><li> 버퍼 (A)의 1 mL의에 재현 탁 수지는 부드러운 10 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 재현 탁 버퍼 B 1 용액 (5 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 재현 탁 버퍼 C 1 ㎖ (10 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li></ol></li><li> t (200 mM의 이미 다졸과 완충액 A) 버퍼 (400)의 E μL를 첨가하여 단백질을 용리수지 O. 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 mL의 원심 분리 관에 정제 된 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다. </li><li> 다음 연속 원심 분리에 의해 정제 된 단백질을 탈염. <ol><li> 정제 된 단백질의 400 μL에 (이 160 밀리미터에서 200 밀리미터에서 이미 다졸 농도를 감소) 100 μL 완충액 A를 추가합니다. 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 0.5 mL를 ultracentrifugal 필터로 정제 된 단백질을 적용합니다. 5 분 동안 14,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 여과 액을 취소하고 다시 보유 및 원심 분리기를 희석 400 μL 완충액 A를 추가합니다. 이미 다졸 농도가 아래 4 mm로 떨어질 때까지 원심 분리 / 희석주기를 계속합니다. 각 원심 분리 ~ 70 μL (또는 약 7 배)까지 500 μl를 집중하는 경우 예를 들어, 두 개의 사이클 appr, 출발 160 mM의 이미 다졸 농도 (7 × 7 = 49 배)을 줄일oximately 3.3 mm이다. </li><li> BCA 분석 (21)를 사용하여 탈염 샘플의 단백질 농도를 측정한다. 주 : 제조자의 지침에 따라 탈염은 BCA 분석에 대한 허용 한계 이하로 이미 다졸 농도를 감소시킬 필요가있다. 본 연구실은 민감하기 때문에 BCA 분석을 선호 큰 동적 범위를 가지며, 더 적은 단백질을 단백질의 변화를 나타낸다. 그러나, 단백질의 농도를 측정하는 다른 방법은 BCA 분석을 대체 할 수있다. 핵심은 각 방법의 장점과 한계를 인식하는 것입니다. </li></ol></li><li> 1X의 최종 농도 5 배 기본 샘플 버퍼를 추가하고 전기를 진행합니다. 또한, 매장 샘플 나중에 분석을 위해 -20 ºC에서. </li></ol> 4. 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE). 주의 : 미 중합 아크릴 아미드는 신경독이다. 적절한 보호 GEA을 착용아르 자형. <ol><li> 다음과 같이 비 변성 PAGE 젤을 준비합니다. <ol><li> 깨끗한 유리 플레이트를 사용하여 주조 스탠드 주조 겔 카세트를 준비한다. 작은 자석 교반기 위에 그라데이션 메이커를 놓고 각 챔버에 작은 교반 막대를 배치합니다. </li><li> (/ V W) 아크릴 아미드 및 2 % (W / V) 비스 아크릴 스톡 용액은 5 %와 10 %를 준비하여 40 % (W / V) 네이티브 해결 버퍼에서 아크릴 아마이드 겔 용액. 비스 아크릴 아미드하는 총 아크릴 아미드의 비율이 37.5 있는지 확인하십시오 : 1. 얼음에 칠 쏟아져하기 전에. 주 : 여기에서 사용되는 비 변성 PAGE 시스템은 램 믈리 SDS-PAGE 시스템과 본질적으로 동일하고, SDS (22)를 생략하여. </li><li> 중합을 개시 아크릴 아미드 솔루션 (물에서 제조 / v)의 원액 w (10 %에서) 황산 암모늄을 추가합니다. 황산 암모늄의 최종 농도는 0.1 %이다 (W / V). </li><li> 그라데이션 메이커의 두 챔버에 아크릴 아미드 솔루션을 따르십시오. 출구 튜브 삽입 B를etween 겔 카세트의 판, 자석 교반기를 활성화하고 그라데이션 메이커 밸브를 엽니 다. 10 % 비 변성 그라데이션 젤 - 5를 따르십시오. </li><li> 일단 부, 이소프로판올의 얇은 층으로 겔을 오버레이하여 겔을 30 분 동안 중합 할 수있다. 이 기간 동안, 네이티브 해결 버퍼에 신선한 5 % 아크릴 아마이드 겔 용액을 준비합니다. 젤 세트 후, 아이소 프로필 알코올을 부어 물총 병에서 탈 이온수로 겔의 상단을 씻어. </li><li> 상기 제조 한 5 % 겔 용액 (정확히 같은 4.1.3에 기재되어 있음)과 황산 암모늄을 추가 한 유리판가 가득 할 때까지 중합 된 겔 위에 붓는다. 젤 빗를 삽입합니다. 오버레이 젤은 추가로 30 분 동안 중합하도록 허용합니다. </li><li> 겔 중합되면, 전기 영동 장치에 겔 카세트를 조립한다. 또한, 사용할 준비가 될 때까지 젖은 종이 타월 및 플라스틱 랩에 싸서 4 ºC에서 젤을 저장합니다. </li></ol></li><li> 일단 비 변성 PAGE 젤 ELEC에 조립영동 장치는 10 배 네이티브 실행 버퍼 재고 신선한 준비 1X 기본 실행 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 각 웰 유리 주사기를 사용으로, (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 10 μg의로드. </li><li> 웰 중 하나에 (1X 네이티브 실행 완충액에 희석 된) 고 분자량 천연 단백질 표준로드 2 μL. </li><li> (- 4.5 시간 약 4) 55 V, 4 ºC에서 젤을 실행 염료 전면 겔을 실행 할 때까지. </li><li> 비 변성 겔뿐만 아니라, 표준 SDS-PAGE (22)에 의해 정제 된 단백질의 분취 량을 분석한다. <ol><li> 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 완충액 (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 샘플의 분취 량 (10 μg의)를 섞는다. </li><li> 5 분 동안 100 ºC에서 품어 12 표준 % 및 / 또는 15 % SDS-PAGE 젤 (22)에로드합니다. </li><li> 20 분 동안 80V에서 실행하고 염료 전면 겔 (도망 때까지 120 V에서이 약의 추가이다itional 12 % 겔 75 분, 및 15 % 겔을 120 분). </li></ol></li></ol> 5. 떠올리 활동 및 단백질 염색법. <ol><li> 전기 신중 별도의 유리판에 이어 탈 이온수 50 ㎖를 함유하는 겔 트레이에 비 변성 겔 옮긴다. 부드러운 5 분 동안 흔들와 젤을 씻어. 물을 버리고이 세척 단계를 세 번 반복한다. </li><li> 다음과 같이 기판 오버레이 분석을 수행합니다. <ol><li> 형광 펩타이드 기질 SUC-LLVY-AMC를 포함하는 버퍼를 개발의 1 mL를 넣고 겔에 걸쳐 균일하게 확산. 30 분 37 ºC에서 품어. 주 : 유리로드 또는 겔 릴리 (별도의 유리판, 플라스틱에 사용되는 작은 쐐기)는 겔상의 액체를 확산하는데 사용될 수있다. </li><li> 조심 의한 절단 된 펩티드 기질에 겔 촬상 시스템의 UV transilluminator가 겔 상으로 전송 및 형광을 관찰한다. 기록 이미지입니다. 조심스럽게 겔 바 전송겔 트레이 (CK). </li><li> 부드럽게 흔들 5 분 동안 탈 이온수 50 mL로 두 번 씻어 겔. </li><li> 부드럽게 흔들 60 분 동안 콜로이드 쿠마시 염색 용 시약을 10 mL로 젤을 염색. 배경까지 50 mL의 물 Destain 젤은 분명해진다. 이 염색 공정뿐만 아니라 표준 SDS-PAGE 겔에 적용된다. </li></ol></li></ol>

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Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+20S+proteasome+assembly+factor+requires+a+C-terminal+HbYX+motif+for+proteasomal+precursor+binding.">A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly.">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li><li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 재조합 고세균 프로 테아 좀을 이용하여 비 변성 PAGE를 테아 조립체 분석에 결합 방법의 이점을 보여준다. 프로 테아 서브 유닛의 박테리아 동시 발현의 일반적인 방법 9,11 신속한 분석이 가능하지만 키 어셈블리 중간체를 공개하지 않을 수 있습니다. 우리 조립체 이벤트의 더 넓은 영상을 개발하는 혼합 용 해물과 동시 발현을 조합 한 제안. 이러한 결합 접근...

Multiprotein 단지는 수많은 중요한 세포 활동 1을 수행한다. 이 단지의 많은, 더 많은 그들의 조립 2,3에 대한보다 자신의 구조와 기능에 대한 알려져있다. 프로 테아는 하나의 복잡하고 삶의 모든 영역에서 발견된다. 진핵 생물에서이 분자 기계는 유비퀴틴 / 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 핵심이며, 세포 내 단백질 분해 (4)의 주요 경로를 제공합니다. 20S 프로 테아 솜을, 또는 코어 입자 (CP) (5), 즉, 19S 규제 입자 (RP) (6)에 의해 하나 또는 양 말단에서 캡핑 될 수합니다 (26S 프로 테아라고 함) 진핵 테아는 두 개의 주요 서브 어셈블리로 이루어진다. 20 대 프로 테아 큰 구획 단백질 분해 효소이다. 그 급 구조가 절대적으로 삶의 모든 영역에 걸쳐 보존과 구조적으로 관련 서브 유닛의 두 가지 유형을 포함하는 4 ~ 7 원환의 스택으로 구성되며, α; 그리고 5,7,8을 β. 진핵 생물에있어서, 2 개의 외부 링은 각각 일곱 별개의 α 서브 유닛으로 구성되며, 두 개의 내부 링은 각각 일곱 별개 β 소단위로 구성된다; 단백질 분해 활성은 β 서브 유닛의 세 내에 존재한다. 대조적으로, 고세균 및 세균의 CP 링은 일반적으로 오직 하나의 α 형과 β 서브 유닛의 한 형태로 구성된다. 고세균 프로 테아 좀은 그들의 조성 단순성 및 그들의 대응 진핵 9-13과 공통 어셈블리기구 공유 모두 테아 조립체를 연구하는 것이 중요 모델 시스템을 제공했다. 요약하면, α 서브 유닛은 서브 유닛 조립 β있는에 발판 역할을하는 첫 번째 α 링으로 조립한다. 상승을주는 결과 반 프로 테아 좀 (α 7 β 7) 이량은 완전히 CP (α 7 β 7 β 7 α 7) 조립합니다. 이량 동안 propeptides은 β 서브 유닛에 존재자기 촉매 촉매 N 말단 트레오닌를 노출, 제거됩니다. 어셈블리를 모델링 고세균 프로 테아 좀의 사용은 빈번하게 대장균에서 재조합 고세균 테아 단백질의 생성을 이용한다. 이 다양한 조합으로 제조 될 수있는 서브 유닛 자체 프로 테아 좀을 생산하지 않는 숙주 유기체에서 WT 및 돌연변이 버전 모두 같은 수 있기 때문에 가치가있는 접근법이다. 다중 단백질 복합체의 조립을 모니터링 생화학 조립 중간체 및 전구체에서 완전히 조립 된 복합체를 분리하는 분류 방법의 일종이 필요합니다. 때문에 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE) 비 변성 뛰어난 해결 능력, 다양한 큰 multiprotein 단지 14 ~ 17의 분류에서 특히 유용한 것으로 입증되었습니다. 재조합 고세균 테아 생산 및 비 변성 PAGE의 조합 dissectin에서 강력한 접근되었다g의 프로 테아 좀 어셈블리 9,11,12,18. 그러나,이 방법이 적용되는 (즉. α 및 β 서브 유닛의 동시 발현 재조합을 통해) 통상의 방법은 중요한 단점을 갖는다. 조립 협동 반응은 강하게 농도 의존적 3이다. 세포 내부의 단백질 농도로 인해 배제 체적 효과 (19)이 매우 높은 점을 감안, 조립 반응은 생체 내에서 급속하게 진행. 따라서 α와 β 서브 유닛이 동시 발현 될 때 중요한 조립 중간체를 그리워하는 것이 가능하다. 여기, 우리는 재조합 고세균 프로 테아 서브 유닛을 사용하여 프로 테아 좀 어셈블리의 연구에서 결합 된 접근 방식에 대한 주장한다. 이 방식에서, 두 동시 발현과 해물 혼합 방법이 이용된다. 동시 발현 덜 노동 집약적이기 때문에 전자는 어셈블리의 신속한 분석이 가능합니다. 후자는 혼합하여 α와 β 서브 유닛, 별도의 표현에 따라 달라집니다. 이 requi 비록동시 발현보다 고해상도 조금 더 많은 노력, 그것은 동시 발현 동안 놓친 중간체를 검출 할 수있는 능력에 의해 보상 이상이다. 함께, 이러한 방법은 두 테아 조립체의 더욱 완전한 그림을 제공 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

프로 테아 좀은 삶의 모든 영역에서 발견된다. 자신의 어셈블리를 완전히 이해되지 않지만 그들은, 진핵 생물의 세포 내 단백질 분해의 주요 경로를 제공합니다. 모든 프로 테아 두 heptameric α 서브 유닛 반지 사이에 끼워 두 heptameric β 서브 유닛 반지를 포함, 구조적으로 보존 된 코어 입자 (CP), 또는 20S 프로 테아 좀 (proteasome)를 포함한다. 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 생물의 대응에 비해 구조적으로 간단, 아직 그들은 모두 공통의 조립 메커니즘을 공유 할 수 있습니다. 따라서, 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 세포 프로 테아 조립을위한 중요한 모델이 될 것을 계속한다. 특히, 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)와 결합 고세균 (20S)의 프로 테아 좀의 재조합 발현는 프로 테아 좀의 생합성에 많은 중요한 통찰력을 산출했다. 여기, 우리는 고세균 프로 테아 α의 동시 발현의 일반적인 전략을 개선하는 방법을 논의하고 β 서브 유닛 전에 nondenaturi하기NG PAGE. 우리는 신속하고 효율적인 있지만, 혼자 동시 발현 방식이 키 어셈블리 중간체를 놓칠 수 있다는 것을 보여줍니다. 프로 테아 좀의 경우, 동시 발현은 반 프로 테아 좀의 감지, 중간 포함하는 하나의 완전한 α-링과 하나의 완전한 β-링을 허용하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 중간 용이 해물 혼합을 통해 검출된다. 우리는 해물 혼합과 동시 발현을 결합하는 어셈블리를 분석에 더 철저 접근을 산출, 아직 노동 nonintensive 유지하는 것이 좋습니다. 이 접근은 다른 재조합 multiprotein 복합체의 연구에 유용 할 수있다.

α 서브 유닛이 형태 링 (9)에 결합하면 프로 테아 좀 어셈블리 (그림 1) 시작합니다. C는 말단 헥사 히스티딘은 (그의 태깅) 유도체 (표 1) 태그로서 호열 Methanococcus maripaludis S2에서 α 서브 유닛을 대장균에서 발현되는 경우가 설명 될 수있다. 재조합-α 단백질 자신의 페이지를 비 변성하여 ICAR 그래피 분석 한 결과, 두 개의 밴드 (도 2A, 레인...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

이 프로토콜은 서브 유닛의 동시 발현 재조합 프로 테아 좀 어셈블리의보다 철저한 검사를 위해 혼합 postlysis 서브 유닛을 모두 사용합니다.

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K 조회수.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  이 프로토콜은 서브 유닛의 동시 발현 재조합 프로 테아 좀 어셈블리의보다 철저한 검사를 위해 혼합 postlysis 서브 유닛을 모두 사용합니다. 

비디오: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

생물학

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

생체공학

The Proteasome Structure

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no longer needed. In this pathway, the protein that needs to be eliminated undergoes a process called ubiquitination, where a chain of ubiquitin molecules is attached to the 48th lysine residue of the target protein. This ubiquitin modification helps the proteasome distinguish between a target protein and a healthy protein.
The proteasome is an ATP-driven, large multi-subunit protease (26S) found in the nucleus and cytoplasm of all eukaryotes. The 26S proteasome comprises a central hollow cylindrical core (the 20S) and ring-shaped protein caps (19S). The 20S core particle is barrel-shaped, containing stacked rings with proteolytic active sites lined inside. The 19S caps act as gatekeepers and regulatory units of the proteasome. They are present at one or both ends of the core.
Caps have ubiquitin receptors, ubiquitin hydrolase, and unfoldase, each with a unique function. The ubiquitin receptor recognizes and allows ubiquitin-tagged proteins into the core, the hydrolase deubiquitinase cleaves ubiquitin from the substrate, and the unfoldase protein unfolds target proteins as they enter the protein core.
The hexameric unfoldases create a ring structure in the proteasome cap and belong to a large class of AAA proteins. Their mechanistic action is similar to other ATP-dependent helicases that cause DNA unwinding. The ATP-bound unfoldase ring binds a folded target protein held in place by its ubiquitin tag at the proteasomal cap. Next, a conformational change, driven by ATP hydrolysis, pulls the target protein substrate into the 20S core and strains the ring structure. As a result, when a protein is subjected to pulling forces, it can undergo two possible outcomes&#8212; it may either undergo partial unfolding and enter the cylindrical core, or it can retain its structure while partially retracting.
Highly stable substrates generally require hundreds of cycles of ATP hydrolysis before being pulled through the AAA ring. Once de-ubiquitylated and unfolded, the target protein is exposed to proteases inside the proteasomal core for digestion. In contrast to free cellular proteases, which quickly dissociate after their action on the target protein, the proteasome core holds the target protein until it is fully digested into smaller peptides. These small peptides are then released into the cytosol for further processing.&#160;

프로테아솜 구조

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no ...