Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Support Funds Grant (RSFG) von der Indiana University-Purdue University, Indianapolis, und teilweise durch eine Auszeichnung von der American Heart Association 14GRNT20390154, zu ARK unterstützt

1. Bakterielle Expression. Anmerkung: Expressionsplasmide in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Die Klonierung von Archaea - Proteasom - Untereinheit - Gene und die Erzeugung von Expressionsplasmiden sind an anderer Stelle beschrieben 18,20. Kurz gesagt, Plasmide für die rekombinante Koexpression von Untereinheiten verwenden eine bizistronischen Operon - Strategie , die bei der Beschaffung von 18,20 vergleichbaren Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten hilft. Die Expressions unten aufgeführten Parameter wurden empirisch bestimmt für die Proteasom-Untereinheiten in dieser Studie als optimal. Es kann notwendig sein Ausdruck für andere Proteasom-Mutanten zu optimieren, für Proteasomen aus anderen Archaea Arten oder für andere rekombinante Protein-Komplexe (siehe Diskussion). <ol><li> Verwandeln Expressionsplasmid von Interesse in chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen. </li><li> In 1 bis 2 &amp; mgr; l Plasmid (in der Regel 50 bis 100 ng) zu einem Aliquot von DE3-Zellen, die frisch auf Eis aufgetaut wurden, und weiter auf Eis für 20 Minuten inkubiert. </li><li> Hitzeschock die Zellen bei 42 ° C für 45 s und das Rückrohr Eis für additionl 2 min. </li><li> 1 ml LB-Medium und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln (150 Upm) für 1 h. </li><li> Verteilt 100-200 &amp; mgr; l des Transformationsgemisch auf LB-kan-Platten (Platten, die festes LB-Medium, supplementiert mit Kanamycin (alle Plasmide, die in dieser Studie encode Resistenz gegen dieses Antibiotikum verwendet wird)). Die Platten bei 37 ºC O / N. </li><li> Am nächsten Morgen, eine einzelne Kolonie von der LB-kan Platte in 3 ml flüssiges LB-kan Medien in einem Glaskulturröhrchen impfen. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für etwa 2,5 bis 3 h, oder bis die Trübung beobachtet. </li><li> Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) in einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zelle Kulture mit einer geeigneten Menge von vorgewärmtem LB-kan - Medium auf eine OD 600 von 0,4 in einem Endvolumen von 6 ml. Lebenslauf bei 37 ºC für 40 min schütteln. </li><li> Induzieren die Proteinexpression in den Flüssigkulturen durch IPTG aus einer Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt wird. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für ca. 6 - 7 h. </li><li> Ernte Bakterienzellkulturen in ihrer Gesamtheit in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1,5 ml einer Kultur in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie weitere 1,5 ml der gleichen Kultur zu dem Pellet. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.11, bis die gesamte Kultur in das Mikrozentrifugenröhrchen geerntet. </li><li> Lagern Sie die induzierten Pellets bei -80 ° C bis Lyse. </li></ol> 2. Bakterienlyse und Lysate Mischen. Hinweis: </strong&gt; Für Proben, über die Co-Expression untersucht, Abschnitt 2.1 (und seinen Unterabschnitten) folgen. Für Proben Lysat Mischen erfordern, folgen Sie Abschnitt 2.2 (und seine Unterabschnitte). Der TSP (Total, Lösliche, Pellet) Analyse, die im Protokoll enthalten ist, ist nützlich in der Proteinexpression zu optimieren, die die α und β-Untereinheiten während des Lysats kombiniert mischen (siehe Diskussion) dazu beitragen kann etwa gleiche Mengen an. Es bietet auch eine wichtige Kontrolle , wenn Downstream - Ergebnisse nicht wie erwartet (dh überprüft er , dass Protein exprimiert wurde und löslich). Daher empfehlen wir dringend zunächst TSP Analyse. Sobald ein optimales Protokoll für eine bestimmte Untereinheit-Kombination erreicht worden ist, wird TSP Analyse nicht unbedingt erforderlich, weshalb er als optional weiter unten beschrieben wird. <ol><li> Lyse von Bakterienzellen und Herstellung von löslichen Fraktionen. <ol><li> Auftauen induzierte Zellpellet auf Eis für 5 min. Resuspendieren des Pellets in 600 &amp; mgr; l Lyse-Puffer. </li><li> IncUbate der Suspension bei 30 ºC unter Schütteln (150 Upm) für 30 min Gesamt Rohlysat zu erzeugen. Hinweis: Der folgende Schritt und dem Unterabschnitt , die optional sind folgende. </li><li> Entfernen Sie die zwei 25 &amp; mgr; l-Aliquots aus dem gesamten Rohlysat in getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und führen TSP-Analyse wie folgt. <ol><li> Um einen der zwei 25 ul Aliquots, 5X SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X hinzu. Das Röhrchen mit &quot;T&quot; für &quot;total Rohlysat&quot;. </li><li> Inkubieren Sie die &quot;T&quot; Probe bei 100 ºC für 5 Minuten, um vollständig Proteine ​​denaturieren. </li><li> Inzwischen nehmen Sie die zweite 25 - ul - Aliquot und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert werden . Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne das winzige Pellet zu stören, und übertragen sie auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Beschriften Sie diese neue Röhre &quot;S&quot; für &quot;lösliche Fraktion&quot;. </li><li> Um die winzigen Pellet links behind im vorherigen Schritt, fügen Sie 25 ul Lysepuffer und Wirbel wieder zu suspendieren. Beschriften Sie diese Röhre &quot;P&quot; für &quot;Pellet-Fraktion&quot;. </li><li> In 6 ul 5X SDS-Probenpuffer auf die &quot;S&quot; und &quot;P&quot; Rohre und Inkubation bei 100 ° C, wie oben beschrieben. Hinweis: Wenn die TSP Proben werden an diesem Tag nicht verwendet werden , um Expression zu analysieren, können sie bei -20 ° C eingefroren werden , bis sie benötigt werden . Einmal aufgetaut, müssen sie bei 100 ºC werden reinkubiert, wie oben beschrieben, unmittelbar vor dem Laden auf ein 12% und / oder 15% Standard-SDS-PAGE-Gel. </li></ol></li><li> Während die TSP - Analyse durchgeführt wird, Zentrifuge die restlichen 550 &amp; mgr; l Gesamt Rohlysat für 10 min bei 10.000 × g (oder der gesamten 600 &amp; mgr; l Gesamt Rohlysat wenn TSP Analyse nicht durchgeführt wird ). Sammeln Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist das lösliche Lysat, das zur Reinigung verwendet wird. </li></ol></li><li> Lysate Mischung. <ol><li> Führen Sie Lyse wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2. </li><li> Mischen Sie 600 &amp; mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien die gewünschte α-Untereinheit mit 600 &amp; mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien exprimiert das gewünschte β-Untereinheit exprimieren. bei 37 ºC inkubieren langsam mit Schütteln für 30 min. Hinweis: Es kann notwendig sein , um die Inkubationszeit zu optimieren maximale Anordnung während des Lysats zu erreichen Mischen (siehe Diskussion). Die Zeit und die Temperatur hier vorgestellten sind optimal für die rekombinanten Proteine in dieser Studie und wurden an anderer Stelle 18 bestimmt. </li><li> Zentrifuge das gemischte Lysat bei 10000 × g für 10 min löslichem Material von unlöslichen Pellet zu trennen. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie diese gemischten löslichen Lysat zur Proteinreinigung. </li></ol></li></ol> 3. Proteinaufreinigung über immobilisiertem Cobalt Affinity Resin(ICH AUTO). <ol><li> Äquilibrieren des Harzes. <ol><li> Gründlich Resuspendieren des Harzes durch die Flasche Invertieren und Übertragung 50 &amp; mgr; l der Aufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 700 × g für 2 min zu Pellets Harz. Sorgfältig absaugen Überstand. Hinweis: Wir führen Pipette Aspiration eine blaue 1 ml Pipettenspitze mit der Masse der Flüssigkeit zu entfernen. Eine weiße 2 ul Spitze wird zur Feinsteuerung der Entfernung des verbleibenden Überstand verwendet, um eine sehr dünne Schicht aus flüssigem verlassen die Perlen bedeckt. </li><li> 1 ml Puffer A Mix sanft zu resuspendieren Harz und Zentrifuge bei 700 × g für 2 min Harz zu pelletieren. aspirieren vorsichtig den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li></ol></li><li> Anwenden zuvor erhaltenen löslichen Lysat in Abschnitt 2.1 oder 2.2 auf die äquilibrierte Harz. Inkubieren Sie die Röhrchen mit leichter Rotation bei 4 ° C für 60 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g &lt;/ Em&gt; für 5 min und den Überstand vorsichtig absaugen. </li><li> Das Harz wird als nicht-spezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen, folgt. <ol><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer A und Inkubation mit sanftem für 10 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer B (Puffer A mit 5 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer C (Puffer A mit 10 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. </li></ol></li><li> Eluieren des Proteins durch Zugabe von 400 ul Puffer E (Puffer A mit 200 mM Imidazol) to das Harz. Inkubieren mit sanften bei 4 ° C für 5 min zu schaukeln. Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Übertragen Überstand mit gereinigtem Protein in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Desalt das gereinigte Protein durch serielle Zentrifugation wie folgt. <ol><li> Bis 400 &amp; mgr; l gereinigtes Protein, mit 100 &amp; mgr; l Puffer A (dies reduziert Imidazole Konzentration von 200 mM bis 160 mM). Anwenden gereinigtem Protein auf 0,5 ml Ultrazentrifugalmühle Filter mit einem 10 kDa Molekulargewicht cut-off. Zentrifuge bei 14000 × g für 5 min. </li><li> Entsorgen Sie das Filtrat und fügen 400 ul Puffer A des Retentats und Zentrifuge wieder zu verdünnen. Weiter die Zyklen der Zentrifugation / Verdünnung bis Imidazolkonzentration unter 4 mm fällt. Als ein Beispiel, wenn jede Zentrifugierung 500 ul konzentriert bis auf ~ 70 &amp; mgr; l (oder ca. 7-fach), dann zwei Zyklen des Ausgangs 160 mM Imidazol-Konzentration (7 × 7 = 49-fach) reduzieren auf ca.oximately 3,3 mM. </li><li> Messung der Proteinkonzentration der entsalzte Probe unter Verwendung des BCA - Assay 21. Anmerkung: Die Entsalzung erforderlich Imidazole Ebenen unter der Toleranzgrenze für den BCA - Assay zu reduzieren, wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. Unser Labor bevorzugt den BCA-Assay, da sie empfindlich ist, hat einen großen dynamischen Bereich und zeigt deutlich weniger Protein-zu-Protein-Variante. Jedoch können andere Verfahren der Proteinkonzentration zu bestimmen, kann für die BCA-Assay ersetzt werden. Der Schlüssel ist, der jedes Methoden Vorteile und Grenzen zu beachten. </li></ol></li><li> In 5X nativen Probenpuffer auf eine Endkonzentration von 1X und fahren Sie mit der Elektrophorese. Alternativ Proben bei -20 ° C für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Achtung: Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie geeignete Schutz gear. <ol><li> Bereiten Sie die nicht-denaturierenden PAGE-Gel wie folgt. <ol><li> Bereiten Sie die Gel-Kassette für die Verwendung von sauberen Glasplatten Gießen und Gießen stehen. Platzieren Sie Steigung Hersteller auf der Spitze eines kleinen Magnetrührer und legen Sie eine kleine Rührstab in jede Kammer. </li><li> Unter Verwendung von 40% (w / v) Acrylamid und 2% (w / v) Bisacrylamid-Stammlösungen, bereiten 5% und 10% (w / v) Acrylamid-Gel-Lösungen in einem nativen Auflösungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Gesamt Acrylamid zu Bisacrylamid beträgt 37,5: 1. Chill auf Eis vor dem Gießen. Anmerkung: Die nicht - denaturierenden PAGE - System verwendet dabei im wesentlichen identisch mit dem Laemmli SDS-PAGE - System ist, mit SDS 22 weggelassen. </li><li> Hinzufügen Ammoniumpersulfat (von einer 10% (w / v) Stammlösung in Wasser hergestellt) mit den Acrylamidlösungen Polymerisation zu initiieren. Endkonzentration Ammoniumpersulfat 0,1% (w / v). </li><li> Gießen Sie die Acrylamid-Lösungen in den beiden Kammern des Gradienten ausgestattet. Mit dem Ablaufschlauch eingeführt bwischen die Platten der Gel-Kassette, aktivieren Sie den Magnetrührer und die Gradienten-Hersteller Ventile öffnen. Gießen Sie mit dem 5 - 10% nicht-denaturierenden Gradienten-Gel. </li><li> Einmal gegossen, überlagern das Gel mit einer dünnen Schicht aus Isopropanol und erlauben das Gel für 30 min zu polymerisieren. Während dieser Zeit, bereiten Sie frisches 5% Acrylamid-Gel-Lösung in nativen Lösung Puffer. Nachdem das Gel-Sets, gießen Isopropanol aus und die Spitze des Gels mit VE-Wasser aus einer Spritzflasche spülen. </li><li> Zum 5% Gel-Lösung oben hergestellt, fügen Ammoniumpersulfat (genau wie in 4.1.3 beschrieben) und gießen Sie auf der Oberseite des polymerisierten Gels bis Glasplatten voll sind. Legen Sie Gelkamm. Erlauben es dem überlagerten Gel für weitere 30 min zu polymerisieren. </li><li> Sobald Gel polymerisiert wird, Gel-Kassette in Elektrophorese-Vorrichtung montieren. Alternativ speichern Sie das Gel bei 4 ° C, für den Einsatz in angefeuchteten Papiertüchern und Plastikverpackung, bis sie bereit gewickelt. </li></ol></li><li> Sobald nicht denaturierenden PAGE-Gel in elec zusammengebauttrophorese Gerät, füllen den Tank mit 1X nativen Laufpuffer frisch zubereitet von einem 10fach nativen Laufpuffer Lager. </li><li> Last 10 ug gereinigtes Protein, am Ende des Abschnitts 3 erhalten, in jedes Well ein Glas Spritze. </li><li> Last 2 &amp; mgr; l mit hohem Molekulargewicht native Protein-Standard (verdünnt in 1X nativen Laufpuffer) in einem der Brunnen. </li><li> Führen Gel bei 55 V und 4 ° C, bis die Farbstofffront läuft das Gel aus (ca. 4-4,5 h). </li><li> Zusätzlich zu dem nicht - denaturierenden Gel, Analyse Aliquots des gereinigten Proteins , das durch Standard - SDS-PAGE 22. <ol><li> Mischungs Aliquots (10 &amp; mgr; g) der gereinigten Proteinproben, am Ende der Sektion 3 erhalten, mit 5X-SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X. </li><li> 5 min bei 100 ºC inkubieren und auf Standard - 12% und / oder 15% SDS-PAGE - Gelen 22 laden. </li><li> für 20 Minuten bei 80 V laufen und dann bei 120 V, bis die Farbstofffront das Gel läuft weg (das ist etwa ein Additional 75 min für eine 12% Gel und 120 min für eine 15% Gel). </li></ol></li></ol> 5. Visualizing Aktivität und Protein-Färbung. <ol><li> Nach der Elektrophorese sorgfältig getrennte Glasplatten und übertragen Sie die nicht-denaturierenden Gel auf eine Gelträger, der 50 ml VE-Wasser. Spülen Sie Gel mit sanfter 5 min zu schaukeln. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. </li><li> Führen Substrat Overlay-Assay wie folgt. <ol><li> 1 mL Puffer für die Entwicklung des fluorogenen Peptidsubstrats Suc-LLVY-AMC enthält und verteilt gleichmäßig über das Gel. für 30 min bei 37 ºC inkubieren. Hinweis: Ein Glasstab oder ein Gel Ausrücker (kleinen Keil aus Kunststoff zur getrennten Glasplatten verwendet wird ) verwendet werden kann , um die Flüssigkeit auf das Gel zu verteilen. </li><li> übertragen Sie vorsichtig das Gel auf den UV-Transilluminator des Gels Abbildungssystem und beobachten Fluoreszenz aufgrund der gespaltenen Peptidsubstrats. Nehmen Bild. übertragen Sie vorsichtig die Gel back zur Gelträger. </li><li> Spülen Sie das Gel zweimal mit 50 ml VE-Wasser für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Beflecken das Gel mit 10 ml einer kolloidalen Coomassie-Färbung Reagenz für 60 min unter leichtem Schütteln. Entfärben Gel mit 50 ml Wasser, bis Hintergrund wird klar. Diese Färbung Schritt gilt für die Standard-SDS-PAGE-Gelen als auch. </li></ol></li></ol>

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<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir zeigen den Nutzen eines kombinierten Ansatzes Assemblierungsintermediate zur Analyse von PAGE unter Verwendung von rekombinanten Archaea Proteasomen nicht denaturierenden. Die übliche Methode 9,11 von bakteriellen Co - Expression von Proteasom - Untereinheiten ermöglicht eine schnelle Analyse kann aber keine Schlüssel Assemblierungsintermediate offenbaren. Wir schlagen vor, die Kombination von Co-Expression mit Lysat Mischen ein umfassenderes Bild von Montage Ereignisse zu entwickeln. <p class="jov...

Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten 1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage 2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau 4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) 5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) 6 an einem oder beiden Enden verschlossen sein. Das 20S-Proteasom ist ein großer compartmentalized Protease. Seine Quartärstruktur ist absolut in allen Lebensbereichen erhalten und besteht aus einem Stapel von vier siebengliedrige Ringe, die zwei Arten von strukturell verwandte Untereinheiten, α; und ß 5,7,8. In Eukaryoten sind die beiden Außenringe jeweils aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten und die beiden Innenringe jeweils aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten; proteolytische Aktivität liegt innerhalb drei der β-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu werden die CP Ringe aus Archaea und Bakterien in der Regel nur aus einer Art von α und einer Art von β-Untereinheit zusammen. Archaeal Proteasomen sind ein wichtiges Modellsystem zum Studium Assemblierungsintermediate sowohl aufgrund ihrer kompositorischen Einfachheit zur Verfügung gestellt und ihre gemeinsame Montagemechanismus mit ihren eukaryotischen Pendants 9-13 teilen. Kurz gesagt, montieren α-Untereinheiten in α Ringe erste, die dazu dienen als Gerüst, auf die ß-Untereinheiten zusammenstellen. Die resultierenden Halb Proteasomen (α 7 β 7) dimerisieren Hierdurch entstehen zu komplett montierten CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Während Dimerisierung präsentieren die Propeptide auf ß-Untereinheitenautokatalytisch entfernt werden, um die katalytischen N-terminalen Threonine auszusetzen. Die Verwendung von Archaea - Proteasomen Baugruppe Modell nimmt häufig die Vorteile der Herstellung von rekombinanten Proteinen archaeal Proteasom in Escherichia coli. Dies ist eine sinnvolle Annäherung, weil es ermöglicht, die Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen hergestellt werden, da sowohl WT und Mutanten-Versionen in einem Wirtsorganismus, der keine eigene Proteasomen erzeugt. Die Überwachung der Montage von Multiproteinkomplexen erfordert biochemisch eine Art Fraktionierung Methode, die vollständig zusammengebaut Komplexe von Montage Zwischen- und Vorprodukte trennt. Aufgrund ihrer überlegenen Fähigkeit der Lösung, wurde nicht - denaturierenden Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) in der Fraktionierung der verschiedenen großen Multiproteinkomplexe besonders nützlich 14-17 erwiesen. Die Kombination von rekombinanten Archaea Proteasom Produktion und nicht denaturierenden PAGE hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz in dissectin werdeng Assemblierungsintermediate 9,11,12,18. Jedoch ist das übliche Verfahren , mit dem dieser Ansatz angewendet (dh. Über die rekombinante Koexpression von α und β - Untereinheiten) hat einen wichtigen Nachteil. Montage Reaktionen sind kooperativ und stark konzentrationsabhängig 3. Da die Proteinkonzentration innerhalb der Zellen ist sehr hoch 19, aufgrund ausgeschlossen Volumeneffekte, Montage Reaktionen verlaufen schnell in vivo. Daher ist es möglich, wichtige Assemblierungsintermediate wenn α und β-Untereinheiten koexprimiert werden zu verpassen. Hier streiten wir für einen kombinierten Ansatz bei der Untersuchung von Assemblierungsintermediate rekombinanten Archaea Proteasom-Untereinheiten verwendet wird. In diesem Ansatz werden beide Koexpression und Lysat Mischverfahren eingesetzt. Erstere ermöglicht eine schnelle Analyse der Montage, da die Co-Expression weniger arbeitsintensiv ist. Letzteres hängt von getrennten Expression von α und β-Untereinheiten, gefolgt von Mischen. Obwohl dieser requires etwas mehr Aufwand als Koexpression, ist es mehr als kompensiert durch die Fähigkeit, Zwischenprodukte zu erfassen, die während der Coexpression verpasst werden. Zusammen können diese beiden Methoden, um ein vollständigeres Bild der Assemblierungsintermediate liefern.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.

Assemblierungsintermediate (Abbildung 1) beginnt , wenn alpha - Untereinheiten zu bilden Ringe 9 zu kombinieren. Dies kann veranschaulicht werden , wenn &amp; agr; -Untereinheiten von der archaeon Methanococcus maripaludis S2 in E. coli exprimiert werden , wie C-terminal Hexahistidin - markierte (His-tagged) -derivate (Tabelle 1). Wenn die rekombinante α-His - Protein durch ICAR und analysiert wurde gereinigt durch nicht - denaturierende PAGE, zwei Banden b...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Aufrufe.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen. 

Serie: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Forschung

Biochemie

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Biologie

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is therefore fundamental for the understanding of cellular processes. However, many protein complexes are dynamic assemblies and are not accessible by conventional structural techniques. Mass spectrometry contributes to the structural investigation of these assemblies, and particularly the combination of various mass spectrometric techniques delivers valuable insights into their structural arrangement.
In this article, we describe the application and combination of two complementary mass spectrometric techniques, namely chemical cross-linking coupled with mass spectrometry and native mass spectrometry. Chemical cross-linking involves the covalent linkage of amino acids in close proximity by using chemical reagents. After digestion with proteases, cross-linked di-peptides are identified by mass spectrometry and protein interactions sites are uncovered. Native mass spectrometry on the other hand is the analysis of intact protein assemblies in the gas phase of a mass spectrometer. It reveals protein stoichiometries as well as protein and ligand interactions. Both techniques therefore deliver complementary information on the structure of protein-ligand assemblies and their combination proved powerful in previous studies.

The architecture of protein complexes is essential for their function. Combining various mass spectrometric techniques proved powerful to study their assembly. We provide protocols for chemical cross-linking and native mass spectrometry and show how these complementary techniques help to elucidate the architecture of multi-subunit protein assemblies.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Zusammenfassung

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Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine in Zellen

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