Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Support Funds Grant (RSFG) von der Indiana University-Purdue University, Indianapolis, und teilweise durch eine Auszeichnung von der American Heart Association 14GRNT20390154, zu ARK unterstützt

1. Bakterielle Expression. Anmerkung: Expressionsplasmide in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Die Klonierung von Archaea - Proteasom - Untereinheit - Gene und die Erzeugung von Expressionsplasmiden sind an anderer Stelle beschrieben 18,20. Kurz gesagt, Plasmide für die rekombinante Koexpression von Untereinheiten verwenden eine bizistronischen Operon - Strategie , die bei der Beschaffung von 18,20 vergleichbaren Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten hilft. Die Expressions unten aufgeführten Parameter wurden empirisch bestimmt für die Proteasom-Untereinheiten in dieser Studie als optimal. Es kann notwendig sein Ausdruck für andere Proteasom-Mutanten zu optimieren, für Proteasomen aus anderen Archaea Arten oder für andere rekombinante Protein-Komplexe (siehe Diskussion). <ol><li> Verwandeln Expressionsplasmid von Interesse in chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen. </li><li> In 1 bis 2 &amp; mgr; l Plasmid (in der Regel 50 bis 100 ng) zu einem Aliquot von DE3-Zellen, die frisch auf Eis aufgetaut wurden, und weiter auf Eis für 20 Minuten inkubiert. </li><li> Hitzeschock die Zellen bei 42 ° C für 45 s und das Rückrohr Eis für additionl 2 min. </li><li> 1 ml LB-Medium und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln (150 Upm) für 1 h. </li><li> Verteilt 100-200 &amp; mgr; l des Transformationsgemisch auf LB-kan-Platten (Platten, die festes LB-Medium, supplementiert mit Kanamycin (alle Plasmide, die in dieser Studie encode Resistenz gegen dieses Antibiotikum verwendet wird)). Die Platten bei 37 ºC O / N. </li><li> Am nächsten Morgen, eine einzelne Kolonie von der LB-kan Platte in 3 ml flüssiges LB-kan Medien in einem Glaskulturröhrchen impfen. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für etwa 2,5 bis 3 h, oder bis die Trübung beobachtet. </li><li> Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) in einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zelle Kulture mit einer geeigneten Menge von vorgewärmtem LB-kan - Medium auf eine OD 600 von 0,4 in einem Endvolumen von 6 ml. Lebenslauf bei 37 ºC für 40 min schütteln. </li><li> Induzieren die Proteinexpression in den Flüssigkulturen durch IPTG aus einer Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt wird. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für ca. 6 - 7 h. </li><li> Ernte Bakterienzellkulturen in ihrer Gesamtheit in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1,5 ml einer Kultur in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie weitere 1,5 ml der gleichen Kultur zu dem Pellet. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.11, bis die gesamte Kultur in das Mikrozentrifugenröhrchen geerntet. </li><li> Lagern Sie die induzierten Pellets bei -80 ° C bis Lyse. </li></ol> 2. Bakterienlyse und Lysate Mischen. Hinweis: </strong&gt; Für Proben, über die Co-Expression untersucht, Abschnitt 2.1 (und seinen Unterabschnitten) folgen. Für Proben Lysat Mischen erfordern, folgen Sie Abschnitt 2.2 (und seine Unterabschnitte). Der TSP (Total, Lösliche, Pellet) Analyse, die im Protokoll enthalten ist, ist nützlich in der Proteinexpression zu optimieren, die die α und β-Untereinheiten während des Lysats kombiniert mischen (siehe Diskussion) dazu beitragen kann etwa gleiche Mengen an. Es bietet auch eine wichtige Kontrolle , wenn Downstream - Ergebnisse nicht wie erwartet (dh überprüft er , dass Protein exprimiert wurde und löslich). Daher empfehlen wir dringend zunächst TSP Analyse. Sobald ein optimales Protokoll für eine bestimmte Untereinheit-Kombination erreicht worden ist, wird TSP Analyse nicht unbedingt erforderlich, weshalb er als optional weiter unten beschrieben wird. <ol><li> Lyse von Bakterienzellen und Herstellung von löslichen Fraktionen. <ol><li> Auftauen induzierte Zellpellet auf Eis für 5 min. Resuspendieren des Pellets in 600 &amp; mgr; l Lyse-Puffer. </li><li> IncUbate der Suspension bei 30 ºC unter Schütteln (150 Upm) für 30 min Gesamt Rohlysat zu erzeugen. Hinweis: Der folgende Schritt und dem Unterabschnitt , die optional sind folgende. </li><li> Entfernen Sie die zwei 25 &amp; mgr; l-Aliquots aus dem gesamten Rohlysat in getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und führen TSP-Analyse wie folgt. <ol><li> Um einen der zwei 25 ul Aliquots, 5X SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X hinzu. Das Röhrchen mit &quot;T&quot; für &quot;total Rohlysat&quot;. </li><li> Inkubieren Sie die &quot;T&quot; Probe bei 100 ºC für 5 Minuten, um vollständig Proteine ​​denaturieren. </li><li> Inzwischen nehmen Sie die zweite 25 - ul - Aliquot und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert werden . Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne das winzige Pellet zu stören, und übertragen sie auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Beschriften Sie diese neue Röhre &quot;S&quot; für &quot;lösliche Fraktion&quot;. </li><li> Um die winzigen Pellet links behind im vorherigen Schritt, fügen Sie 25 ul Lysepuffer und Wirbel wieder zu suspendieren. Beschriften Sie diese Röhre &quot;P&quot; für &quot;Pellet-Fraktion&quot;. </li><li> In 6 ul 5X SDS-Probenpuffer auf die &quot;S&quot; und &quot;P&quot; Rohre und Inkubation bei 100 ° C, wie oben beschrieben. Hinweis: Wenn die TSP Proben werden an diesem Tag nicht verwendet werden , um Expression zu analysieren, können sie bei -20 ° C eingefroren werden , bis sie benötigt werden . Einmal aufgetaut, müssen sie bei 100 ºC werden reinkubiert, wie oben beschrieben, unmittelbar vor dem Laden auf ein 12% und / oder 15% Standard-SDS-PAGE-Gel. </li></ol></li><li> Während die TSP - Analyse durchgeführt wird, Zentrifuge die restlichen 550 &amp; mgr; l Gesamt Rohlysat für 10 min bei 10.000 × g (oder der gesamten 600 &amp; mgr; l Gesamt Rohlysat wenn TSP Analyse nicht durchgeführt wird ). Sammeln Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist das lösliche Lysat, das zur Reinigung verwendet wird. </li></ol></li><li> Lysate Mischung. <ol><li> Führen Sie Lyse wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2. </li><li> Mischen Sie 600 &amp; mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien die gewünschte α-Untereinheit mit 600 &amp; mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien exprimiert das gewünschte β-Untereinheit exprimieren. bei 37 ºC inkubieren langsam mit Schütteln für 30 min. Hinweis: Es kann notwendig sein , um die Inkubationszeit zu optimieren maximale Anordnung während des Lysats zu erreichen Mischen (siehe Diskussion). Die Zeit und die Temperatur hier vorgestellten sind optimal für die rekombinanten Proteine in dieser Studie und wurden an anderer Stelle 18 bestimmt. </li><li> Zentrifuge das gemischte Lysat bei 10000 × g für 10 min löslichem Material von unlöslichen Pellet zu trennen. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie diese gemischten löslichen Lysat zur Proteinreinigung. </li></ol></li></ol> 3. Proteinaufreinigung über immobilisiertem Cobalt Affinity Resin(ICH AUTO). <ol><li> Äquilibrieren des Harzes. <ol><li> Gründlich Resuspendieren des Harzes durch die Flasche Invertieren und Übertragung 50 &amp; mgr; l der Aufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 700 × g für 2 min zu Pellets Harz. Sorgfältig absaugen Überstand. Hinweis: Wir führen Pipette Aspiration eine blaue 1 ml Pipettenspitze mit der Masse der Flüssigkeit zu entfernen. Eine weiße 2 ul Spitze wird zur Feinsteuerung der Entfernung des verbleibenden Überstand verwendet, um eine sehr dünne Schicht aus flüssigem verlassen die Perlen bedeckt. </li><li> 1 ml Puffer A Mix sanft zu resuspendieren Harz und Zentrifuge bei 700 × g für 2 min Harz zu pelletieren. aspirieren vorsichtig den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li></ol></li><li> Anwenden zuvor erhaltenen löslichen Lysat in Abschnitt 2.1 oder 2.2 auf die äquilibrierte Harz. Inkubieren Sie die Röhrchen mit leichter Rotation bei 4 ° C für 60 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g &lt;/ Em&gt; für 5 min und den Überstand vorsichtig absaugen. </li><li> Das Harz wird als nicht-spezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen, folgt. <ol><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer A und Inkubation mit sanftem für 10 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer B (Puffer A mit 5 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li><li> Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer C (Puffer A mit 10 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. </li></ol></li><li> Eluieren des Proteins durch Zugabe von 400 ul Puffer E (Puffer A mit 200 mM Imidazol) to das Harz. Inkubieren mit sanften bei 4 ° C für 5 min zu schaukeln. Zentrifuge bei 700 × g für 5 min. </li><li> Übertragen Überstand mit gereinigtem Protein in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Desalt das gereinigte Protein durch serielle Zentrifugation wie folgt. <ol><li> Bis 400 &amp; mgr; l gereinigtes Protein, mit 100 &amp; mgr; l Puffer A (dies reduziert Imidazole Konzentration von 200 mM bis 160 mM). Anwenden gereinigtem Protein auf 0,5 ml Ultrazentrifugalmühle Filter mit einem 10 kDa Molekulargewicht cut-off. Zentrifuge bei 14000 × g für 5 min. </li><li> Entsorgen Sie das Filtrat und fügen 400 ul Puffer A des Retentats und Zentrifuge wieder zu verdünnen. Weiter die Zyklen der Zentrifugation / Verdünnung bis Imidazolkonzentration unter 4 mm fällt. Als ein Beispiel, wenn jede Zentrifugierung 500 ul konzentriert bis auf ~ 70 &amp; mgr; l (oder ca. 7-fach), dann zwei Zyklen des Ausgangs 160 mM Imidazol-Konzentration (7 × 7 = 49-fach) reduzieren auf ca.oximately 3,3 mM. </li><li> Messung der Proteinkonzentration der entsalzte Probe unter Verwendung des BCA - Assay 21. Anmerkung: Die Entsalzung erforderlich Imidazole Ebenen unter der Toleranzgrenze für den BCA - Assay zu reduzieren, wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. Unser Labor bevorzugt den BCA-Assay, da sie empfindlich ist, hat einen großen dynamischen Bereich und zeigt deutlich weniger Protein-zu-Protein-Variante. Jedoch können andere Verfahren der Proteinkonzentration zu bestimmen, kann für die BCA-Assay ersetzt werden. Der Schlüssel ist, der jedes Methoden Vorteile und Grenzen zu beachten. </li></ol></li><li> In 5X nativen Probenpuffer auf eine Endkonzentration von 1X und fahren Sie mit der Elektrophorese. Alternativ Proben bei -20 ° C für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Achtung: Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie geeignete Schutz gear. <ol><li> Bereiten Sie die nicht-denaturierenden PAGE-Gel wie folgt. <ol><li> Bereiten Sie die Gel-Kassette für die Verwendung von sauberen Glasplatten Gießen und Gießen stehen. Platzieren Sie Steigung Hersteller auf der Spitze eines kleinen Magnetrührer und legen Sie eine kleine Rührstab in jede Kammer. </li><li> Unter Verwendung von 40% (w / v) Acrylamid und 2% (w / v) Bisacrylamid-Stammlösungen, bereiten 5% und 10% (w / v) Acrylamid-Gel-Lösungen in einem nativen Auflösungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Gesamt Acrylamid zu Bisacrylamid beträgt 37,5: 1. Chill auf Eis vor dem Gießen. Anmerkung: Die nicht - denaturierenden PAGE - System verwendet dabei im wesentlichen identisch mit dem Laemmli SDS-PAGE - System ist, mit SDS 22 weggelassen. </li><li> Hinzufügen Ammoniumpersulfat (von einer 10% (w / v) Stammlösung in Wasser hergestellt) mit den Acrylamidlösungen Polymerisation zu initiieren. Endkonzentration Ammoniumpersulfat 0,1% (w / v). </li><li> Gießen Sie die Acrylamid-Lösungen in den beiden Kammern des Gradienten ausgestattet. Mit dem Ablaufschlauch eingeführt bwischen die Platten der Gel-Kassette, aktivieren Sie den Magnetrührer und die Gradienten-Hersteller Ventile öffnen. Gießen Sie mit dem 5 - 10% nicht-denaturierenden Gradienten-Gel. </li><li> Einmal gegossen, überlagern das Gel mit einer dünnen Schicht aus Isopropanol und erlauben das Gel für 30 min zu polymerisieren. Während dieser Zeit, bereiten Sie frisches 5% Acrylamid-Gel-Lösung in nativen Lösung Puffer. Nachdem das Gel-Sets, gießen Isopropanol aus und die Spitze des Gels mit VE-Wasser aus einer Spritzflasche spülen. </li><li> Zum 5% Gel-Lösung oben hergestellt, fügen Ammoniumpersulfat (genau wie in 4.1.3 beschrieben) und gießen Sie auf der Oberseite des polymerisierten Gels bis Glasplatten voll sind. Legen Sie Gelkamm. Erlauben es dem überlagerten Gel für weitere 30 min zu polymerisieren. </li><li> Sobald Gel polymerisiert wird, Gel-Kassette in Elektrophorese-Vorrichtung montieren. Alternativ speichern Sie das Gel bei 4 ° C, für den Einsatz in angefeuchteten Papiertüchern und Plastikverpackung, bis sie bereit gewickelt. </li></ol></li><li> Sobald nicht denaturierenden PAGE-Gel in elec zusammengebauttrophorese Gerät, füllen den Tank mit 1X nativen Laufpuffer frisch zubereitet von einem 10fach nativen Laufpuffer Lager. </li><li> Last 10 ug gereinigtes Protein, am Ende des Abschnitts 3 erhalten, in jedes Well ein Glas Spritze. </li><li> Last 2 &amp; mgr; l mit hohem Molekulargewicht native Protein-Standard (verdünnt in 1X nativen Laufpuffer) in einem der Brunnen. </li><li> Führen Gel bei 55 V und 4 ° C, bis die Farbstofffront läuft das Gel aus (ca. 4-4,5 h). </li><li> Zusätzlich zu dem nicht - denaturierenden Gel, Analyse Aliquots des gereinigten Proteins , das durch Standard - SDS-PAGE 22. <ol><li> Mischungs Aliquots (10 &amp; mgr; g) der gereinigten Proteinproben, am Ende der Sektion 3 erhalten, mit 5X-SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X. </li><li> 5 min bei 100 ºC inkubieren und auf Standard - 12% und / oder 15% SDS-PAGE - Gelen 22 laden. </li><li> für 20 Minuten bei 80 V laufen und dann bei 120 V, bis die Farbstofffront das Gel läuft weg (das ist etwa ein Additional 75 min für eine 12% Gel und 120 min für eine 15% Gel). </li></ol></li></ol> 5. Visualizing Aktivität und Protein-Färbung. <ol><li> Nach der Elektrophorese sorgfältig getrennte Glasplatten und übertragen Sie die nicht-denaturierenden Gel auf eine Gelträger, der 50 ml VE-Wasser. Spülen Sie Gel mit sanfter 5 min zu schaukeln. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. </li><li> Führen Substrat Overlay-Assay wie folgt. <ol><li> 1 mL Puffer für die Entwicklung des fluorogenen Peptidsubstrats Suc-LLVY-AMC enthält und verteilt gleichmäßig über das Gel. für 30 min bei 37 ºC inkubieren. Hinweis: Ein Glasstab oder ein Gel Ausrücker (kleinen Keil aus Kunststoff zur getrennten Glasplatten verwendet wird ) verwendet werden kann , um die Flüssigkeit auf das Gel zu verteilen. </li><li> übertragen Sie vorsichtig das Gel auf den UV-Transilluminator des Gels Abbildungssystem und beobachten Fluoreszenz aufgrund der gespaltenen Peptidsubstrats. Nehmen Bild. übertragen Sie vorsichtig die Gel back zur Gelträger. </li><li> Spülen Sie das Gel zweimal mit 50 ml VE-Wasser für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Beflecken das Gel mit 10 ml einer kolloidalen Coomassie-Färbung Reagenz für 60 min unter leichtem Schütteln. Entfärben Gel mit 50 ml Wasser, bis Hintergrund wird klar. Diese Färbung Schritt gilt für die Standard-SDS-PAGE-Gelen als auch. </li></ol></li></ol>

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R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir zeigen den Nutzen eines kombinierten Ansatzes Assemblierungsintermediate zur Analyse von PAGE unter Verwendung von rekombinanten Archaea Proteasomen nicht denaturierenden. Die übliche Methode 9,11 von bakteriellen Co - Expression von Proteasom - Untereinheiten ermöglicht eine schnelle Analyse kann aber keine Schlüssel Assemblierungsintermediate offenbaren. Wir schlagen vor, die Kombination von Co-Expression mit Lysat Mischen ein umfassenderes Bild von Montage Ereignisse zu entwickeln. <p class="jov...

Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten 1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage 2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau 4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) 5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) 6 an einem oder beiden Enden verschlossen sein. Das 20S-Proteasom ist ein großer compartmentalized Protease. Seine Quartärstruktur ist absolut in allen Lebensbereichen erhalten und besteht aus einem Stapel von vier siebengliedrige Ringe, die zwei Arten von strukturell verwandte Untereinheiten, α; und ß 5,7,8. In Eukaryoten sind die beiden Außenringe jeweils aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten und die beiden Innenringe jeweils aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten; proteolytische Aktivität liegt innerhalb drei der β-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu werden die CP Ringe aus Archaea und Bakterien in der Regel nur aus einer Art von α und einer Art von β-Untereinheit zusammen. Archaeal Proteasomen sind ein wichtiges Modellsystem zum Studium Assemblierungsintermediate sowohl aufgrund ihrer kompositorischen Einfachheit zur Verfügung gestellt und ihre gemeinsame Montagemechanismus mit ihren eukaryotischen Pendants 9-13 teilen. Kurz gesagt, montieren α-Untereinheiten in α Ringe erste, die dazu dienen als Gerüst, auf die ß-Untereinheiten zusammenstellen. Die resultierenden Halb Proteasomen (α 7 β 7) dimerisieren Hierdurch entstehen zu komplett montierten CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Während Dimerisierung präsentieren die Propeptide auf ß-Untereinheitenautokatalytisch entfernt werden, um die katalytischen N-terminalen Threonine auszusetzen. Die Verwendung von Archaea - Proteasomen Baugruppe Modell nimmt häufig die Vorteile der Herstellung von rekombinanten Proteinen archaeal Proteasom in Escherichia coli. Dies ist eine sinnvolle Annäherung, weil es ermöglicht, die Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen hergestellt werden, da sowohl WT und Mutanten-Versionen in einem Wirtsorganismus, der keine eigene Proteasomen erzeugt. Die Überwachung der Montage von Multiproteinkomplexen erfordert biochemisch eine Art Fraktionierung Methode, die vollständig zusammengebaut Komplexe von Montage Zwischen- und Vorprodukte trennt. Aufgrund ihrer überlegenen Fähigkeit der Lösung, wurde nicht - denaturierenden Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) in der Fraktionierung der verschiedenen großen Multiproteinkomplexe besonders nützlich 14-17 erwiesen. Die Kombination von rekombinanten Archaea Proteasom Produktion und nicht denaturierenden PAGE hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz in dissectin werdeng Assemblierungsintermediate 9,11,12,18. Jedoch ist das übliche Verfahren , mit dem dieser Ansatz angewendet (dh. Über die rekombinante Koexpression von α und β - Untereinheiten) hat einen wichtigen Nachteil. Montage Reaktionen sind kooperativ und stark konzentrationsabhängig 3. Da die Proteinkonzentration innerhalb der Zellen ist sehr hoch 19, aufgrund ausgeschlossen Volumeneffekte, Montage Reaktionen verlaufen schnell in vivo. Daher ist es möglich, wichtige Assemblierungsintermediate wenn α und β-Untereinheiten koexprimiert werden zu verpassen. Hier streiten wir für einen kombinierten Ansatz bei der Untersuchung von Assemblierungsintermediate rekombinanten Archaea Proteasom-Untereinheiten verwendet wird. In diesem Ansatz werden beide Koexpression und Lysat Mischverfahren eingesetzt. Erstere ermöglicht eine schnelle Analyse der Montage, da die Co-Expression weniger arbeitsintensiv ist. Letzteres hängt von getrennten Expression von α und β-Untereinheiten, gefolgt von Mischen. Obwohl dieser requires etwas mehr Aufwand als Koexpression, ist es mehr als kompensiert durch die Fähigkeit, Zwischenprodukte zu erfassen, die während der Coexpression verpasst werden. Zusammen können diese beiden Methoden, um ein vollständigeres Bild der Assemblierungsintermediate liefern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Acrylamide (40%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610104</td>
			<td style="width:309px;">Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters</td>
			<td style="width:123px;">EMDMillipore</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">ATP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A7699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">Pierce</td>
			<td style="width:105px;">23225</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Bisacrylamide (2%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610142</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">B8026</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">DNaseI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">DN25</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP172</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">E.coli BL21 competent cells</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">69450</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">GelCode Blue</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">24592</td>
			<td style="width:309px;">Colloidal coomassie stain reagent for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Gel doc EZ system</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708270</td>
			<td style="width:309px;">Gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Gel releasers</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1653320</td>
			<td style="width:309px;">Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glass rod</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11-380B</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">49767</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP3865</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14-813-38</td>
			<td style="width:309px;">Glass syringe for loading gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">H2010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">HMW Native calibration kit</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:105px;">170445-01</td>
			<td style="width:309px;">High molecular weight protein standards</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hoefer SG30</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">03-500-277</td>
			<td style="width:309px;">Gradient maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Imidazole</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">280671</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">IPTG</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">I8500</td>
			<td style="width:309px;">For induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP26181</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">K0010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">L6876</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:165px;">MgCl2</td>
			<td style="width:123px;">Fluka analytical</td>
			<td style="width:105px;">630680</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1658002EDU</td>
			<td style="width:309px;">Gel electrophoresis apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S640-3</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S318-1</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Pefabloc SC</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:105px;">11429876001</td>
			<td style="width:309px;">Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">pET42</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">70562</td>
			<td style="width:309px;">Expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Precision plus all blue standard</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610373</td>
			<td style="width:309px;">Molecular protein standard for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Quickchange mutagenesis kit</td>
			<td style="width:123px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:105px;">200521</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP166</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Suc-LLVY-AMC</td>
			<td style="width:123px;">Enzo lifesciences</td>
			<td style="width:105px;">BML P802-0005</td>
			<td style="width:309px;">Fluorogenic substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Talon Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:105px;">635502</td>
			<td style="width:309px;">Immobilized-cobalt affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">TEMED</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">T7024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tris</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">T8600</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">93426</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tryptone</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">211699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">UV sample tray</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708271</td>
			<td style="width:309px;">For UV imaging of gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">212720</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.

Assemblierungsintermediate (Abbildung 1) beginnt , wenn alpha - Untereinheiten zu bilden Ringe 9 zu kombinieren. Dies kann veranschaulicht werden , wenn &amp; agr; -Untereinheiten von der archaeon Methanococcus maripaludis S2 in E. coli exprimiert werden , wie C-terminal Hexahistidin - markierte (His-tagged) -derivate (Tabelle 1). Wenn die rekombinante α-His - Protein durch ICAR und analysiert wurde gereinigt durch nicht - denaturierende PAGE, zwei Banden b...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Aufrufe.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen. 

Serie: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human cancers, is processed by farnesylation and carboxymethylation due to the presence of a &#39;CAAX&#39; box motif at the C-terminus. An engineered baculovirus system was used to express farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in insect cells and has been described previously. Here, we describe the detailed, practical purification and biochemical characterization of the protein. Specifically, affinity and ion exchange chromatography were used to purify the protein to homogeneity. Intact and native mass spectrometry was used to validate the correct modification of KRAS4b and to verify nucleotide binding. Finally, membrane association of farnesylated and carboxymethylated KRAS4b to liposomes was measured using surface plasmon resonance spectroscopy.

Prenylation is an important modification on peripheral membrane binding proteins. Insect cells can be manipulated to produce farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in quantities that enable biophysical measurements of protein-protein and protein-lipid interactions

Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...