Los autores desean agradecer a los padres y adolescentes que participaron en el estudio CHAMACOS. También deseamos agradecer al personal de CHAMACOS que trabajó en el estudio, especialmente a Katherine Kogut, MS, por todo el trabajo que hizo como directora de proyecto para este estudio. Los autores también desean agradecer el otorgamiento del Instituto Nacional de Abuso de Drogas 1R01DA035300.

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Berkeley y la Universidad de California, San Francisco. Los participantes estaban programados para llegar al laboratorio entre las 4: 30-5: 00 PM. 1. Enjuague la boca <ol><li> Pida al participante que vaya al baño y enjuague su boca con agua solamente. Haga que el participante swish con agua fría durante 5-10 s y escupir en el fregadero. Haga esto sólo una vez. </li><li> Diga al participante, &quot;Esto es para asegurarse de que no hay comida o migas en los dientes para la colección de saliva.&quot; </li></ol> 2. Período de descanso <ol><li> Usher participante en una sala solitaria y les permiten sentarse por lo menos 10 min. Haga que el participante complete cuestionarios no invasivos o no provocadores, como una hoja de información de contacto y cuestionarios de vida diaria, así como ver un video pacífico de 3 minutos de vida marina. </li></ol> 3. Colección de saliva # 1 (PRe-tensión <ol><li> Coloque una línea para indicar 1 mL de saliva en un criovial de 2 mL, y dígale al participante que llene el criovial con esta línea. Recoja la saliva del participante a través de una baba pasiva a través de una paja de dos pulgadas en el criovial de 2 ml 36 y congele inmediatamente (-80 ° C). </li><li> Diga al participante: &quot; Le pediré que llene este vial con saliva hasta esta línea.La manera de hacerlo es dejar que la saliva se acumule en su boca y luego dejarlo correr a través de la pajita dentro del vial. No escupir porque se obtiene burbujas en su muestra - sólo deje que la saliva correr a través de la paja.Será de ayuda si usted no habla mientras está haciendo esto.Por favor, trate de no toser flegma, sólo queremos saliva normal Mantenga un ojo en su vial de saliva y lo lleno que es.Si hay burbujas en la parte superior de su saliva, deben ir a través de la línea, por lo que sólo hay saliva líquido hasta la línea.Dime cuando se llena A la línea.Re algunos cuadros de la comida fijada en la pared (PUNTO HACIA FOTOS), puesto que el pensamiento de alimentos preferidos hace la boca de la gente agua. &quot; </li><li> Ofrecer agua después de que el participante haya completado la muestra de saliva. No permita que el participante guarde el agua; Retírelo cuando haya terminado. </li></ol> 4. Período de preparación <ol><li> Diga al participante: &quot;En unos pocos minutos, queremos que usted dé un discurso de cinco minutos sobre cómo usted es un buen amigo.Hay un comité de dos revisores capacitados que están en la habitación de al lado que van a estar escuchando A su discurso Su trabajo es hacer que los encuestados creen que usted es un buen amigo Quieren que usted explique qué cosas le hacen un buen amigo a otros Usted está compitiendo contra muchas otras personas por lo bueno que está en dar Su discurso y convencer a la gente de que usted es un buen amigo.Los revisores son expertos en juzgar la expresión facial y el movimiento del cuerpo, y van a comSu discurso a otras personas en el estudio. Usted puede notar que los revisores están tomando notas. Esto es para que podamos revisar sus notas en un momento posterior. También se grabará en vídeo para que podamos evaluar su rendimiento más tarde. Tendrás 3 minutos para prepararte para tu discurso. Recuerde, su discurso debe explicar lo que es acerca de usted que te hace un buen amigo, y usted está compitiendo contra otras personas por lo creíble que eres. Después de eso, te llevaré a la siguiente habitación, donde te presentarás a los revisores y darás tu discurso de 5 minutos. Habrá otra tarea que viene después del discurso, pero los revisores le harán saber cuál es la tarea después del discurso. ¿Tiene usted alguna pregunta? Puede escribir notas si lo desea, pero no podrá llevarlas a la habitación con usted. Ok, por favor comience a prepararse. Regresaré dentro de unos minutos. </li><li> Entregue el papel del participante, la pluma y el portapapeles para que puedan tomar notas. </li><li> Deje al participante solo en la habitación. </li><li> Espere 3 minutos y luego vuelva a la habitación. </li></ol> 5. Configuración de TSST <ol><li> Diga al participante: &quot;Está bien, es hora de ir al lado y empezar.&quot; Si el participante tiene notas escritas, tomarlas del participante. Diga, &quot; Puedo tomar esos de usted ahora. Gracias.&quot; </li><li> Camine al participante a la sala de TSST e indique que deben hacer frente a los confederados ya la cámara de vídeo. </li><li> Inicie la grabación de vídeo antes de que el participante entre en la sala. Registre todas las tareas de habla y matemáticas (aproximadamente 10 minutos en total). </li><li> Haga que el entrevistador de la juventud presente el comité. &quot;Esto es_ (nombre del participante) _ (Participante) _, ¿conoces alguna de estas personas?&quot; <ol><li> Si el participante responde que no, el entrevistador de la juventud dice: &quot;Está bien, puedes empezar.&quot; </li><li> Si el participante responde sí, hSi el participante indica quién sabe, y haga que el entrevistador de la Juventud diga &quot;bien, _ (confederado) __, por favor, disculpe, los jueces necesitan ser personas que no te conocen &quot; . </li></ol></li></ol> 6. Tarea de Discurso de TSST <ol><li> Diga a los confederados: &quot; Por favor, díganos por qué son buenos amigos. Comiencen a hablar ahora &quot;. </li><li> Ajuste el temporizador durante 5 min. Iniciar temporizador. </li><li> Después de 30 s de silencio, utilice una de las siguientes indicaciones para mantener al participante hablando. Utilice las instrucciones en orden cada vez que haya una pausa de 30 s. <ol><li> Di &quot;Todavía tienes tiempo, por favor continúa&quot;. </li><li> Diga &quot;¿Por qué más eres un buen amigo?&quot; </li><li> Di &quot;Por favor, den un ejemplo de cuándo fuiste un buen amigo&quot;. </li><li> Di: &quot;Sé tan creativo como quieras, ¿por qué más eres un buen amigo?&quot; </li><li> Después de haber utilizado todas las indicaciones anteriores, continúeRemanente con &quot;Todavía tienes tiempo, por favor continúa&quot;. </li></ol></li><li> Después de 5 min, Confederado 1 dicen: &quot;Por favor, detenga su tiempo.&quot; (Proceda a la tarea matemática.) </li></ol> 7. Tarea de matemáticas TSST <ol><li> Haga que confederado diga: &quot;Ahora vamos a pedirle que cuente en voz alta hacia atrás. Comience en 423, y cuente hacia atrás por 7. Siga contando hacia atrás por 7 en voz alta hasta que le digamos que deje de. Si comete un error, Le haremos saber y le pediremos que comience de nuevo.Por favor, sea tan rápido y preciso como sea posible Ahora queremos que comience a contar hacia atrás - comience en 423 y sustraiga 7. Siga substrayendo 7 en voz alta hasta que le digamos que deje de hacerlo. &quot; </li><li> Ajuste el temporizador durante 5 min. Iniciar temporizador. </li><li> Si el participante parece confundido, ¿han confederado yo decir, &quot;le gustaría que lo repita?&quot; </li><li> Si el participante comete un error, dígale a Confederado:S incorrecto. Comience de nuevo. 423 menos 7. &quot; </li><li> Si el participante no comienza a contar en voz alta después de 30 s, pasar al siguiente problema de matemáticas más fácil, utilizando las mismas instrucciones que las anteriores con las mismas indicaciones. </li><li> Utilice lo siguiente como los problemas matemáticos más fáciles incluyen (en este orden): 423 - 5 =? 95 - 5 =? 66 - 3 =? 6 + 3 =? </li><li> Si el participante se detiene después de cada respuesta correcta para esperar la confirmación, dígale a Confederado 1: &quot;Continúe contando hacia atrás por 7. Sólo le corregiremos si comete un error, de lo contrario, siga adelante &quot; . </li><li> Después de 5 min, Confederado 1 dicen, &quot;El tiempo ha terminado. Por favor, vaya al lado para dar su próxima muestra de saliva.&quot; </li><li> Acompañar al participante de vuelta a la habitación solitaria. </li></ol> 8. Detener Protocolo <ol><li> Autorizar a ambos confederados a detener el protocolo antes de tiempo. Ambos confederados no están obligados a consultar entre sí antes de hacerlo. </li><li> SiEl participante llora o aparece con los ojos llorosos, se vuelve obviamente enojado o agresivo, o muestra de otra manera la aflicción o si el participante comienza a postura en una manera que aparece agresiva o impar, pare el protocolo inmediatamente pero tan normalmente como sea posible. </li><li> Diga: &quot;El tiempo se ha acabado. Por favor, vaya al lado para dar su siguiente muestra de saliva &quot;. </li><li> Participante directo a la siguiente habitación. </li></ol> 9. Muestra de Saliva # 2 (15 min después del estrés) <ol><li> Cuando la juventud vuelva a entrar en la siguiente habitación, ajuste el temporizador durante 15 minutos. </li><li> Diga al participante: &quot;Esa es la parte más difícil de su visita, gracias por hacer eso y vamos a hablar de ello en un segundo, es hora de recoger otra saliva&quot;. </li><li> Si el participante menciona TSST, diga al participante: &quot;Podemos hablar de eso en un minuto, pero por favor haga la muestra de saliva primero. </li><li> Coloque una línea para indicar 1 mL de saliva en un criovial de 2 mL, yPara llenar el criovial a esta línea. Recoja la saliva del participante a través de una baba pasiva a través de una paja de dos pulgadas en el criovial de 2 ml 36 y congele inmediatamente (-80 ° C). </li><li> Ofrezca agua para beber después de que el participante haya completado la muestra de saliva. No permita que el participante guarde el agua; Retírelo cuando haya terminado. </li></ol> 10. Revisión <ol><li> Diga al participante: &quot;Okay, hablemos de las actividades de habla y matemáticas.Usted puede haber adivinado esto ya, pero el propósito de todas esas actividades era crear estrés.Usted puede haber notado que los&quot; revisores &quot;no eran exactamente el más amigable En el mundo, ¿no? &quot;Bueno, en primer lugar, quiero decirles que los &#39;revisores&#39; son sólo ayudantes de investigación.Su trabajo es hacer que los adolescentes hagan las actividades, pero no dar ninguna retroalimentación positiva, no importa cuán grande lo haces.Ad nada que ver con su rendimiento en esas tareas - que actúan de la misma manera con cada participante que se reúnen. &quot; &quot;Usted probablemente se está preguntando por qué lo hicimos.Teníamos una razón científica para hacerlo.Estamos estudiando si la cantidad de estrés que experimenta en su vida cotidiana afecta la forma en que responde a una situación estresante como esta. El estudio consiste en entender por qué los adolescentes reaccionan de manera diferente al estrés y estamos midiendo algo llamado cortisol en sus muestras de saliva como una manera de ver su respuesta al estrés &quot;. &quot;Si usted encontró el discurso y las matemáticas estresantes, usted no está solo! Elegimos hacer discursos y hacer matemáticas porque sabemos que aunque son seguros de hacer, hacen que mucha gente nerviosa. Necesitábamos hacer esas actividades nosotros mismos, y todos lo encontramos realmente difícil Incluso los científicos de Berkeley ensuciaron las matemáticas Y todos dijimos &#39;éstos eran los largosT 10 minutos de mi vida! &#39; ¿Lo sentiste así? &quot;Unas cuantas cosas más que quiero mencionar ...&quot; [IF VIDEOTAPED] &quot;Hemos grabado este video por dos razones: la razón principal es que nuestros jefes pueden asegurarse de que ESTAMOS haciendo la actividad correctamente, y en el futuro también podremos ver los videos para obtener más información sobre las expresiones faciales de las personas. Es sólo otra manera de ver cómo los adolescentes responden de manera diferente al estrés &quot;. [SI NO ESTÁ VIDEOTAPADA] &quot;La verdad es que en realidad no estábamos grabándonos, la cámara no estaba encendida, era otra parte de la actuación para hacerla más estresante&quot;. &quot;La gente allí no estaba realmente escribiendo notas sobre su actuación, sino que estaban escribiendo notas sin sentido como parte de su actuación. &quot;Nos gustaría pedirle que por favor no mencione esta actividad a nadie que pueda estar enEl estudio, incluso si son su mejor amigo, hermano, hermana, primo, o lo que sea. Si otras personas aprenden sobre esta actividad antes de que vayan a la visita, pueden practicar su discurso en casa o ponerse nervioso antes de que lleguen hasta aquí, y tendrán una experiencia totalmente diferente a la que usted acaba de hacer. No queremos que eso suceda. ¿Esto tiene sentido? Por la misma razón, si usted habla con sus padres sobre esto, por favor pídales que no lo digan a sus amigos o familiares en el estudio &quot;. &quot;¿Tiene usted alguna pregunta?&quot; </li></ol> 11. Muestra de Saliva # 3 (30 min después del estrés) <ol><li> Coloque una línea para indicar 1 mL de saliva en un criovial de 2 mL y dígale al participante que llene el criovial con esta línea. Recoja la saliva del participante a través de una baba pasiva a través de una paja de dos pulgadas en el criovial de 2 ml 36 y congele inmediatamente (-80 ° C). </li><li> Ajuste el temporizador durante 15 min. </li><li> Ofrecer agua a drinK después de que el participante haya completado la muestra de saliva. No permita que el participante guarde el agua; Retírelo cuando haya terminado. </li></ol> 12. Muestra de Saliva # 4 (45 min después del estrés) <ol><li> Coloque una línea para indicar 1 mL de saliva en un criovial de 2 mL y dígale al participante que llene el criovial con esta línea. Recoja la saliva del participante a través de una baba pasiva a través de una paja de dos pulgadas en el criovial de 2 ml 36 y congele inmediatamente (-80 ° C). </li><li> Ofrezca agua para beber después de que el participante haya completado la muestra de saliva. No permita que el participante guarde el agua; Retírelo cuando haya terminado. </li></ol>

There are no competing financial interests.

El presente estudio pretendía confirmar la eficacia de una versión modificada del TSST con jóvenes vulnerables. El proyecto CHAMACOS presentó la muestra óptima para probar la efectividad de una TSST contextual apropiada modificada, ya que es única (las muestras mexicanas a menudo se excluyen de la investigación) y representa una muestra de jóvenes que han experimentado una adversidad significativa en la vida temprana 37 . Los resultados confirman el éxito de la TSST modificada al provocar un aumento significativo en el cortisol de las muestras pre-estrés a post-estrés, así como una recuperación relativa normal de la TSST en el momento en que se recogió la última muestra de saliva. Este estudio proporciona una valiosa herramienta para el campo a través tanto del protocolo contextualmente apropiado de la TSST, así como una exploración de los factores que influenciaron las modificaciones de la TSST original. Hay varios pasos críticos para la configuración y administración de la TSSTQue debe ser atendido. En primer lugar, ambos confederados necesitan usar batas de laboratorio blancas, sentarse detrás de una mesa, y tener una grabación de cámara de video y apuntando hacia donde el participante estará de pie antes de que el participante sea introducido en la habitación. El participante se encuentra en todo el TSST, mientras que el comité se sienta. En segundo lugar, debe haber un confederado de cada sexo, y los confederados deben ser de raza / etnia similar al participante, y aparecer de una edad similar a la del participante (este estudio utilizó a los jóvenes ligeramente mayores que parecían similares en edad a los participantes ). En tercer lugar, los confederados deben demostrar un efecto plano, con un ligero aburrimiento en todo el protocolo. Confederados deben mirar al participante tanto como sea posible sin mostrar interés durante el TSST. Confederate 2 escribe notas, mientras que Confederate 1 es responsable de administrar instrucciones e instrucciones. Cabe señalar que la realización de la TSST en un emocionalmente &quot;neutral &amp; #34; El estado toma habilidad y práctica. Algunas personas pueden no ser apropiadas para el papel confederado si no son capaces de mantener una cara neutral. Confederados en este estudio fueron seleccionados a mano para ser capaz de mantener la postura neutral durante toda la TSST. Sin embargo, si un participante llega a llorar, triste o agresivo, este personal necesita saber cómo y cuándo intervenir para detener el protocolo. La integridad del TSST también necesita ser evaluada periódicamente a lo largo del estudio para asegurar que no haya deriva en el comportamiento emocional o el guión. En este estudio, los check-ins semanales fueron proporcionados a confederados cuando fueron capaces de solucionar cualquier incidencia inusual con expertos en TSST administración y check-in con preguntas. TSST &quot;refreshers&quot; también fueron proporcionados cada pocos meses para entrenar confederados en el TSST. Se grabaron videos durante el TSST para los participantes cuyas madres dieron su consentimiento, y estos videos fueron revisados ​​para asegurar la veracidad del guión TSST. Por último, algunos investigadores pueden pensar que los participantes que expresaron la traición o la ira en respuesta a la TSST tendrá altas respuestas de cortisol. Sin embargo, este estudio descartó esta noción en los datos, ya que resultó que estos jóvenes eran más propensos a ser no respondedores ( es decir , individuos cuyo cortisol o disminuido o se mantuvo estable a lo largo de la tarea) evaluados a través de sus reacciones de cortisol. Por lo tanto, la adhesión estricta a un protocolo sensible no socavó las tasas de reactividad global, sino que aseguró que el desafío del estresor se tituló al nivel apropiado para estos jóvenes. Por lo tanto, el protocolo TSST estándar habría sido inapropiado tanto desde el punto de vista ético como también científico, ya que la deserción, la falta de respuesta y la &quot;renuncia&quot; fueron una respuesta predominante. Después de ejecutar a unos pocos participantes a través de la TSST original, el TSST original fue modificado para adaptarse mejor a los factores contextuales de esta población debido a respuestas no óptimasEs (es decir , llorando, desprenderse de la tarea, posturas agresivas). El personal del estudio consultó con numerosos investigadores que han utilizado el TSST con poblaciones vulnerables ( por ejemplo , orfanatos, centros de justicia juvenil, poblaciones maltratadas) pero ninguna de las modificaciones se ajusta perfectamente a las necesidades de este estudio. Los cambios no provocarían una respuesta de cortisol 12 , 27 . Por lo tanto, tres modificaciones principales se aplicaron a la TSST en nuestro estudio, y las modificaciones y motivaciones para estas modificaciones se iluminan a continuación. En primer lugar, es importante no alienar a los participantes. La administración de una tarea de estrés fue importante para este estudio, pero era imprescindible que los participantes no estuvieran perdidos por la deserción, ya que los jóvenes habían sido seguidos longitudinalmente desde que sus madres quedaron embarazadas de ellos. En este estudio, los participantes fueron dSe informó inmediatamente después de la TSST con el fin de garantizar que el estrés cesó para los participantes después de la conclusión de la TSST. Para esta muestra, el personal que administraba el informe debía ser alguien tan desconocido como fuera posible, pero aún así empático, sin una conexión emocional con la juventud. Mientras que esto puede parecer contraintuitivo, cuando el personal que estaba familiarizado y emocionalmente conectado con la juventud les informó sobre el TSST, los jóvenes tienden a tener más inclinación hacia la rumia sobre el TSST y hablar más sobre él, que a veces termina con llorar o sentimientos de resentimiento Hacia ser &quot;engañado&quot;. Un personal desconocido que administraba la sesión informativa ayudó a asegurar que no cortaremos las conexiones longitudinales que la cohorte había hecho con el personal familiar implementando la TSST. Esto se observa como importante dentro de la comunidad latina, pero es algo que muchos estudios longitudinales que desarrollan una fuerte relación con los participantes deben considerar. Usando una persona desconocidaTambién se redujo la probabilidad de que el resumen sirviera para enfatizar aún más a los jóvenes, dadas las respuestas de comportamiento más óptimas que observamos usando personal desconocido. Si bien el debriefing antes de la recolección de dos muestras de saliva más puede referirse a los investigadores que utilizan esta modificación, hay que señalar que este estudio observó el patrón prototipo de respuesta de cortisol después de la conclusión de la TSST (con la mayor concentración venida 15 minutos después de la conclusión del factor de estrés , Y recuperación 30 min después de la conclusión del factor de estrés). Esta modificación se hizo para ser más culturalmente sensible a los jóvenes que pueden haber seguido teniendo una respuesta de estrés después de la TSST debido a su estado vulnerable. En segundo lugar, el protocolo TSST debe ser flexible a los factores individuales del participante. La juventud mexicana-americana en este estudio residen en comunidades agrícolas de bajos recursos y empobrecidas en el Valle Salinas. Las familias CHAMACOS trabajan en condiciones difícilesCondiciones específicas, específicamente salarios bajos, empleo estacional intermitente y largas jornadas de trabajo que eluden las oportunidades de interacciones familiares positivas durante un tiempo de desarrollo adolescente rápido y destacado. Los factores de estrés asociados a una baja SSE / pobreza en la cohorte contribuyen a la inseguridad alimentaria, la vivienda superpoblada, condiciones de vida deficientes y servicios médicos inadecuados para atender las necesidades cognitivas y las necesidades de salud mental. El hecho de que los jóvenes del Valle de Salinas estén desproporcionadamente expuestos a la agitación de la familia ya la violencia juvenil, que se vierte en las escuelas y barrios locales por igual. Estos factores de riesgo se acentúan cada vez más a medida que los jóvenes aprenden a adaptarse a los cambios sociales y económicos rápidamente cambiantes o gradualmente se sensibilizan (o en algunos casos se vuelven insensibles) al carácter impredecible de su vida cotidiana. Un ejemplo de hacer el TSST más flexible para esta población era variar la dificultad de la sección de matemáticas. Dado que este stuDy estaba al tanto de las pruebas cognitivas anteriores y tenía conocimiento de la exposición al patógeno ambiental, lo cual podría afectar al IQ 38 , quedó claro que la tarea matemática de &quot;talla única&quot; típicamente asociada con el TSST no iba a acomodar esta población. Después de otros factores de estrés 39 , 40 , la dificultad matemática se tituló por lo tanto como desafiante pero no imposible para los jóvenes. En tercer lugar, el protocolo TSST debe reconocer y construir sobre el alto sentido de la comunidad y la conexión social dentro de ciertos escenarios culturales. Es importante usar confederados con los que los jóvenes se conectan, por lo que este estudio reclutó confederados que eran ligeramente mayores que los participantes para que parecían de edad y etnicidad similares y provenían de la misma comunidad, de modo que SET provenía de &quot;sus compañeros&quot;. Por el contrario, demasiada conexión social era problemática. Es importante asegurar queLos confederados son apropiadamente neutros y que los confederados eran desconocidos para los participantes. Esto fue crítico para el estudio actual porque aunque el Valle de Salinas es una región relativamente grande, la comunidad juvenil puede ser muy pequeña e interconectada. Por lo tanto, puede ser útil asegurar antes de que el TSST comience que los participantes y confederados no se conocen. Si el participante o confederado reconoció al otro en este estudio, el TSST fue ejecutado con un solo confederado. El hecho de que los confederados de este estudio provengan de la misma comunidad es importante señalar en este contexto (Salinas), que está lejos de ser un ámbito universitario y difícil de encontrar personal que puede trabajar una hora o dos a la vez. Los investigadores de la oficina de campo de este estudio eran muy expertos y altamente entrenados con respecto a la investigación, que no debe ser dado por concedido en términos de mantener el protocolo. Si bien estos resultados son prometedores para validar el uso de un TSST modificadoCon los adolescentes vulnerables, más investigación es necesaria para confirmar la replicabilidad de estos efectos a través de diferentes muestras. En primer lugar, si bien este proyecto tuvo la suerte de poder acceder a una muestra tan única y vulnerable de adolescentes mexicano-americanos, estos resultados deben ser replicados en otras etnias vulnerables para confirmar que esta TSST modificada es lo suficientemente potente para provocar una respuesta de cortisol Otras poblaciones. En segundo lugar, esta muestra se limitó a los de 14 años de edad. Mientras que el muestreo estrecho controlado para el efecto de la edad en la respuesta TSST en esta muestra, la investigación futura podría tratar de reproducir estos efectos en diferentes edades adolescentes y niños, y tal vez a través del desarrollo puberal. Por último, debe tenerse en cuenta que los datos no fueron recogidos de un grupo de comparación utilizando un TSST no modificado, ya que sería antiético con esta muestra dado el alto índice de mal comportamiento y respuestas emocionales que estábamos experimentando al principio con un menos modificado Versión oF del TSST. También hay limitaciones de la técnica TSST en general. Como se mencionó anteriormente, se necesita una práctica significativa para los confederados para mantener la postura neutral en toda la TSST. Al menos 3 personas son necesarias para ejecutar el TSST apropiadamente (2 confederados y 1 experimentador), y el TSST funciona mejor si estas personas son desconocidas para el participante. Por lo tanto, este protocolo es más fácil de ejecutar en los campus de la universidad donde los estudiantes pueden trabajar en el laboratorio de 1-2 horas a la vez, pero menos fácil en lugares remotos o en los lugares donde los confederados son pagados como un trabajo (ya que sólo se pagan Para ~ 1 h de trabajo por TSST). Esta técnica también podría ser un obstáculo para los estudios longitudinales con el personal que trabaja en el proyecto a lo largo del tiempo - este personal bien conocido no debe ser los que administran el TSST. Además, hay una sobrecarga significativa en términos de mantener la integridad de la TSST con el tiempo - los expertos son necesarios para revisar la cinta de vídeoS de la TSST, mantener chequeos semanales con los confederados, y proporcionar sesiones periódicas de &quot;refresco&quot; para asegurar que no haya deriva en la técnica. Además, la TSST es difícil de hacer repetidamente para un participante dado, ya que se basa en un engaño menor y los participantes pueden habituar a la técnica. Las porciones de habla y matemáticas no son contrapesadas, lo que sería más óptimo para otras metodologías como el funcionamiento del sistema nervioso autónomo. No hay partes en el TSST que no sean estresantes, por lo que requiere otra sesión ( es decir , TSST amigable o un TSST con placebo) o algo más ( es decir , un día basal) para tener una comparación sin estrés. Por último, un factor de estrés no basado en un laboratorio podría ser más eficaz ( es decir , karaoke, montañas rusas o casas embrujadas) o más ecológico 41 . Este estudio proporciona la base para futuras investigaciones para utilizar un TSST modificado con jóvenes vulnerables. Futuro longitudinalLos estudios que buscan retener a los participantes en múltiples olas de recopilación de datos también pueden necesitar modificar su enfoque utilizando algunas de estas modificaciones para limitar el desgaste. Además, este estudio demuestra que es realmente posible crear una versión modificada de la TSST que sea culturalmente sensible mientras que todavía titula la reactividad del estrés a un nivel apropiado para capturar las diferencias individuales en la respuesta al cortisol.

La prueba de estrés social de Trier (TSST) 1 se ha convertido en el estándar de oro para inducir el estrés en los entornos de laboratorio 2 . Se trata de un factor de estrés social bien validado y ampliamente utilizado que ha demostrado inducir un aumento de 2-4 veces en el cortisol, la producción biológica producida por el eje Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) 1 , 3 . Un meta-análisis concluyó que dos aspectos clave son esenciales para inducir la mayor reactividad HPA a lo largo de la vida útil: la imprevisibilidad / incontrolabilidad y la amenaza social evaluativa (SET), ambos caracterizan la TSST 3 . La adolescencia puede ser un período clave de tiempo cuando SET es especialmente estresante, marcado por un período de desarrollo sensible, por el cual las interacciones sociales facilitan el aprendizaje 4 . Por ejemplo, durante la pubertad temprana y la adolescencia, la integración con el grupo de pares<html> S se vuelve motivacionalmente saliente 5 . Los aumentos rápidos de los niveles hormonales al inicio de la pubertad influyen en el desarrollo de los circuitos límbicos, lo que conduce a incrementos en el procesamiento de los estímulos sociales relevantes para el estado ( es decir , la admiración) como que tienen una mayor relevancia motivacional 6 . Este aumento en el compromiso afectivo social no sólo influye en las motivaciones y comportamientos en el momento, sino que también influye en los patrones de comportamiento y aprendizaje motivacional a lo largo de largos intervalos. Con el tiempo, este cambio en la priorización de los incentivos sociales puede conducir a la exploración de la salud y la toma de riesgos, lo que puede promover el aprendizaje social y afectivo y las habilidades que sustentan el funcionamiento social de los adultos. Por lo tanto, no es sorprendente que aspectos del funcionamiento social involucrados en la fase del habla del TSST sean una forma potente de estrés para los adolescentes, es decir , el tema del &quot;buen amigo&quot; 7 , 8 ,Sin embargo, las personas sensibilizadas por una historia de trauma o eventos estresantes de la vida pueden estar preparadas para reaccionar mal a situaciones socialmente evaluativas o impredecibles debido a un control emocional pobre o una mayor sensibilidad al estrés y este patrón de respuesta negativa podría contribuir a Como el uso de drogas o la búsqueda de emociones peligrosas, por lo tanto, la comprensión de las respuestas biológicas al SET es de suma importancia en los jóvenes vulnerables. Un puñado de estudios han explorado cómo las variaciones de SET y la incontrolabilidad influyen en la responsividad al estrés. SET se puede aumentar o disminuir en función del número de jueces confederados. El TSST pide 2 confederados, pero es más eficaz con cuatro 10 , y menos eficaz con 1 - 2 confederados 11 , 12 , 13 o con un público virtual o distante 14 , , 16 . La adición de más comentarios negativos aumenta las tasas de SET y de respuesta 11 , 17 , mientras que el comentario positivo reduce las tasas de SET y de respondedor 18 . Las tasas de responsividad están influenciadas por el cambio de incontrolabilidad al: (a) modificar la duración del tiempo que los participantes tienen que preparar el discurso 14 (b) aumentar los recursos psicosociales de los participantes 19 , 20 , 21 , o (c) El TSST 22 . Las modificaciones que mejoran la supresión emocional 23 , la vigilancia o la atención al factor de estrés 24 , 25 , o pensamientos sobre el yo 26, aumentan la capacidad de respuesta del TSST. Por último, el sexo y la edad de conFederado puede influir en la reactividad del estrés a SET 27 , 28 . Estos estudios ilustran que las tasas de respuesta se pueden aumentar o disminuir experimentalmente. En el presente estudio, se modificó el TSST incluyendo sugerencias cronometradas, tareas matemáticas alternativas, el uso de parejas de la misma etnia como confederados, el debriefing inmediatamente después de la conclusión del TSST, y el uso de un examinador de jóvenes desconocido para administrar el informe. Una revisión reciente de los paradigmas estresantes demostró efectos particularmente robustos de la amenaza social evaluativa sobre la elevación del cortisol (respuesta HPA) durante la adolescencia media 29 . Sin embargo, hay preocupaciones válidas sobre el uso del TSST con la juventud vulnerable. Específicamente, las preocupaciones de la protección de los seres humanos pueden ser planteadas para asegurar que los beneficios superen los riesgos, ya que existe el trauma potencial asociado con el TSST cuando los jóvenes ya son vulnerables ( por ejemplo, </Em&gt;, procedentes de ambientes de pobreza y adversidad temprana de la vida). Por lo tanto, existe la necesidad de asegurar que los jóvenes no salgan en un estado de elevada ansiedad o agitación. Sin embargo, las modificaciones al TSST para aliviar o mitigar algunas de estas preocupaciones no deben reducir la eficacia o validez general del estresor. Por ejemplo, estudios anteriores han documentado los efectos de las versiones modificadas de la TSST para los jóvenes vulnerables, pero han tenido un éxito limitado en términos de provocar un aumento en el cortisol 30 , 31 . Además, pueden ser necesarias modificaciones para hacer que el TSST sea más sensible desde el punto de vista cultural y apropiado. Por ejemplo, hay literatura que sugiere que la interacción con individuos de diferentes razas puede inducir el estrés y las reacciones de amenaza 32 . Se ha demostrado que la diferenciación de la composición racial del participante y del comité TSST no afecta la reactividad del cortisol a la TSST 33 ,Act la recuperación del cortisol del TSST 34 . Por lo tanto, el uso de la misma raza / confederados étnicos para el TSST puede eliminar cualquier confusión innecesaria de la raza de los confederados en la amenaza de estereotipo percibida y la recuperación de cortisol de la TSST. El presente estudio se realizó en el contexto de un estudio longitudinal de cohorte de nacimiento de familias mexicanas americanas en California llamado Centro para la Evaluación de la Salud de Madres e Hijos de Salinas (CHAMACOS). Esta muestra se caracteriza por ser altamente vulnerable debido a las altas tasas de pobreza (76% de las familias eran iguales o inferiores al nivel de Pobreza Federal) y un alto número de eventos adversos de la vida temprana (número medio de eventos de vida = 4,5 para la muestra, 3.3). En comparación, un gran estudio retrospectivo realizado por una asociación entre los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos y Kaiser Permanente basada en miles o encuestados encontró que sólo el 13% había reportado 4 o más chiEventos de ldhood 35 . El TSST se administró a los jóvenes en este estudio como parte de una gran subvención NIH destinado a investigar el vínculo entre los eventos adversos de la vida temprana, la reactividad biológica a la amenaza social de evaluación a los 14 años (cuando se administró el TSST) y los comportamientos de riesgo (A la edad de 16 años, la recolección de datos todavía está en curso, grant1R01DA035300). Durante las etapas iniciales de la experimentación de la TSST, observamos que era necesario cambiar el enfoque para que fuera sensible al contexto de las necesidades únicas de esta población y para mitigar las respuestas pobres ( es decir , llorar, enojarse, desvincularse de la TSST). Para ser exactos, tuvimos una tasa de 20% de respuestas de comportamiento pobres a la TSST antes de las modificaciones ( es decir , 4 de 20 TSST participantes lloraron o respondió con ira), mientras que sólo el 5% respondieron con respuestas pobres después de las modificaciones se aplicaron. El personal del estudio también era muy consciente de la importancia de retaEn este estudio longitudinal. Cabe señalar que durante la fase piloto, los individuos que respondieron al TSST con reacciones de estrés extremo durante el interrogatorio fueron, a nivel biológico, &quot;no respondedores&quot;, es decir , no demostraron un aumento de cortisol. Esta yuxtaposición emocional / biológica de estos resultados iniciales también resaltó la necesidad de modificar el TSST para crear las condiciones óptimas para inducir una respuesta biológica apropiada al TSST. Por lo tanto, este estudio proporciona pruebas preliminares de una submuestra de la juventud de la eficacia de la TSST modificado para inducir la reactividad del cortisol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">TSST</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 white lab coats</td>
			<td>Dickies</td>
			<td>83403</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 clip boards</td>
			<td>Staples</td>
			<td>21423</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 pens</td>
			<td>BIC</td>
			<td>GSM609-Blk</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>B00EYU3E7I</td>
			<td>For confederates to sit behind</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video Camera &#38; Tripod</td>
			<td>Sony</td>
			<td>K-86674-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paper&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>For participant&#39;s preparation period</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saliva samples</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latex gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19041171C</td>
			<td>To collect saliva samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 mL cryovials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W985872-100</td>
			<td>4 per participant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80 C freezer</td>
			<td>So-Low</td>
			<td>U85-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#39;&#39; straws&#160;</td>
			<td>Genuine Joe</td>
			<td>GJO58925</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified trier social stress test for vulnerable mexican american adolescents

La Prueba de Estrés Social de Trier (TSST) es un estresor social bien validado y ampliamente utilizado que ha demostrado inducir un aumento de 2-4 veces en el cortisol, la producción biológica producida por el eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal (HPA) en humanos. Mientras que los estudios han explorado cómo las modificaciones al TSST influyen en la responsividad al estrés, pocos estudios han creado un TSST modificado apropiado para los jóvenes vulnerables que provoca una respuesta significativa al estrés por cortisol. Por lo tanto, el presente estudio trató de modificar o ajustar la TSST de una manera culturalmente sensible para una muestra vulnerable de adolescentes de 14 años de edad. El presente estudio se realizó en el contexto de un estudio longitudinal de cohorte de nacimiento de familias mexicanas americanas en California llamado Centro para la Evaluación de la Salud de Madres e Hijos de Salinas (CHAMACOS). La muestra de CHAMACOS fue óptima para probar la efectividad de un TSST modificado culturalmente apropiado, ya que está compuesto por jóvenes mexicanos, que son deDiez excluidos de la investigación. Estos jóvenes también han experimentado significativa adversidad de la vida temprana. Ejemplos de modificaciones incluyeron avisos cronometrados, tareas matemáticas alternativas, el uso de parejas de la misma etnia como confederados, debriefing inmediatamente después de la conclusión de la TSST, y el uso de un examinador juvenil desconocido para administrar el informe. Las muestras de saliva se recogieron al inicio del estudio (después de una fase de reposo) y luego de nuevo a los 15, 30 y 45 minutos después de la TSST para evaluar la concentración de cortisol. Un estudio piloto de 50 participantes (50% mujeres) ha sido analizado para cortisol reacción a la TSST. Los resultados confirmaron que esta versión modificada de la TSST fue exitosa en provocar una reacción significativa de cortisol, con una amplia gama de variabilidad probable debido a las diferencias individuales. Se analizan los objetivos de las modificaciones y las consideraciones étnicas. Este estudio proporciona la base para futuras investigaciones para utilizar un TSST modificado con jóvenes vulnerables.

La muestra estuvo formada por jóvenes de 14 años que formaron parte de un estudio de cohorte establecido y ricamente caracterizado, el Centro de Evaluación de la Salud de Madres e Hijos de Salinas (CHAMACOS). Este estudio consiste en la primera cohorte de 325 familias mexicano-americanas que viven en una comunidad de trabajadores agrícolas en California y seguidas prospectivamente desde que estaban en el útero. El TSST no se administró a la segunda cohorte CHAMACOS de 300 niños seguidos desde la edad de 9 años. Los adolescentes fueron evaluados de participar en el TSST si su CI a escala completa era &lt;70 de una visita previa (12 años), si el adolescente fue diagnosticado con autismo por informe materno, si los comportamientos atípicos extremos mostrados en la clínica en visitas pasadas Desconfianza / paranoia sobre el estudio, ver las cosas o las personas que no están allí - por informe materno), si la puntuación de sus depresores fue ≥ 3 DE por encima de la media por edad y sexo, y si tEl adolescente informó de su participación en una pelea de pandillas en el año anterior. Estos criterios de exclusión se añadieron basándose en una respuesta excesiva inicial al TSST, pero no está claro si estos criterios de exclusión marcaron una diferencia en los resultados finales. Aparte de estos criterios de exclusión, los participantes fueron matriculados sin importar su salud psicológica y física. Al final, 264 adolescentes completaron el TSST en su totalidad, ya sea sin problemas informados o sin problemas hasta el debrief. La Tabla 1 enumera el número de participantes que fueron excluidos y por qué fueron excluidos. No hubo diferencias demográficas entre los que completaron versus no completaron el TSST. Las muestras de saliva se almacenaron a -80 ° C hasta que fueron enviados en hielo seco a colegas de la Iowa State University ( es decir , laboratorio de bioseguridad de nivel II). A su llegada, las muestras de saliva congelada fueron catalogadas y colocadas nuevamente en un congelador de -80 ° C. EnEl día del ensayo, se descongeló cada muestra de saliva y se ensayó en 24 h en duplicado usando kits de inmunoensayo enzimático altamente sensibles bien establecidos. Los coeficientes de variación (CVs) medios intra-ensayo fueron menores que el 2,25% y la CV media inter-ensayos fue del 5,13% para el cortisol. La muestra se reanalizó si el CV para las mediciones duplicadas era superior al 7%. Las estadísticas descriptivas de las mediciones de cortisol junto con las desviaciones estándar en cada muestra se proporcionan en la Tabla 2 y se representan en la Figura 1 . Se realizó una ANOVA de medidas repetidas de 2 x 4 para probar los efectos del sexo en las cuatro muestras de saliva. Hubo un efecto principal en la respuesta al TSST ( F = 9,09, p &lt;0,001), pero el sexo no fue un predictor significativo de la respuesta del cortisol al estrés ( F = 1,03, p = 0,39). El índice de masa corporal promedio fue 23,53, y tampoco fue un predictor significativo de la repeticiónANOVA de cortisol ( F = 1,03, p = 0,38). Como era de esperarse, las pruebas t de muestras pareadas (proporcionadas en la Tabla 3 ) revelaron cambios significativos en el cortisol desde el pre-estrés hasta el inicio de 15 minutos después del estresor, desde el inicio de 15 minutos después del estrés hasta el inicio del post-estrés de 30 minutos y desde el 30 min post-estresor a 45 min post-estresor. El mayor cambio en el cortisol se produjo al comparar la concentración de cortisol antes del estrés con la concentración post-estresante de 30 min, de acuerdo con la investigación previa ( D de Cohen = 0,80) 1 , 3 . Los individuos que fueron marcados como teniendo un tiempo difícil con el TSST tendían a informar mayor reactividad al estrés del estrés, pero informaron haber vuelto a un estado normal antes del final del estudio. Mientras que la concentración post-estresante de 30 minutos fue la concentración más alta de estas muestras, la concentración de cortisol post-estresante de 45 min sugiere que los individuos comenzaronPara recuperarse del factor de estrés, ya que la concentración post-estrés 45 min fue significativamente menor que la concentración de 30 min (ver Tabla 3 ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393fig1.jpg" /> Figura 1: Reactividad del cortisol en el TSST. Medidas de reactividad al cortisol representadas gráficamente con desviaciones estándar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55393/55393fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393table1.jpg" /> Tabla 1: Razones para la Exclusión. Los participantes fueron excluidos del estudio si comenzaron el TSST, pero se detuvieron temprano, se negaron a participar, se retiraron del proyecto o se omitieron debido a problemas relacionados con el proyecto. Tabla 2: Concentraciones medias de cortisol y desviaciones estándar. El cortisol aumentó de las muestras 1-3, y luego disminuyó por la muestra 4. <img alt="Tabla 3" src="/files/ftp_upload/55393/55393table3.jpg" /> Tabla 3: Pruebas t de muestras pareadas. Compara las muestras entre sí en la concentración de cortisol (μg / dL) y las desviaciones estándar (SD) para el cambio de cortisol. Se observaron incrementos significativos en el cortisol desde la muestra de referencia hasta las muestras de post-estrés.

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A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

Aquí presentamos un protocolo que provocó la reactividad del cortisol en una muestra adolescente mexicana vulnerable utilizando una versión modificada del Test de Estrés Social de Trier (TSST). Se recogieron muestras de saliva al inicio del estudio, 15, 30 y 45 minutos después de la TSST. Las investigaciones futuras podrían utilizar este TSST modificado con jóvenes vulnerables.

Una Prueba de Estrés Social Modificada de Trier para Adolescentes Mexicanos Vulnerables

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

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12.7K vistas.  University of California, Berkeley.  Aquí presentamos un protocolo que provocó la reactividad del cortisol en una muestra adolescente mexicana vulnerable utilizando una versión modificada del Test de Estrés Social de Trier (TSST). Se recogieron muestras de saliva al inicio del estudio, 15, 30 y 45 minutos después de la TSST. Las investigaciones futuras podrían utilizar este TSST modificado con jóvenes vulnerables. 

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.