Gli autori vorrebbero ringraziare i genitori e gli adolescenti che hanno partecipato allo studio CHAMACOS. Ringraziamo inoltre il personale CHAMACOS che ha lavorato allo studio, in particolare Katherine Kogut, MS, per tutto il lavoro che ha svolto come project manager per questo studio. Gli autori vorrebbero anche riconoscere che l&#39;Istituto Nazionale di abuso di droga concede la 1R01DA035300.

Questo studio è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale presso l&#39;Università della California, Berkeley e l&#39;Università della California di San Francisco. I partecipanti dovevano arrivare al laboratorio tra le 4:30 e le 5:00. 1. Sciacquare la bocca <ol><li> Chiedere al partecipante di andare in bagno e sciacquare la bocca solo con acqua. Fare che il partecipante squish con acqua fredda per 5-10 s e sputare nel lavandino. Fallo solo una volta. </li><li> Dite al partecipante: &quot;Questo è per assicurarsi che non ci sia cibo o briciole nei denti per la raccolta saliva&quot;. </li></ol> 2. Periodo di riposo <ol><li> Usher partecipa in una stanza solitaria e permette loro di sedersi per almeno 10 minuti. Fai parte del partecipante i questionari non invasivi o non provocatori, come un foglio informativo di contatto e i questionari giornalieri di vita, nonché guardare un video tranquillo di 3 minuti sulla vita marina. </li></ol> 3. Raccolta Saliva # 1 (pri-stress) <ol><li> Mettere una riga per indicare 1 ml di saliva su un crioviale da 2 ml e dire al partecipante di riempire il crioviale in questa linea. Raccogli la saliva del partecipante attraverso un passone attraverso una paglia da 2 pollici nel crioviale da 2 ml 36 e congelare immediatamente (-80 ° C). </li><li> Dica al partecipante: &quot; Ti chiedo di riempire questa fiala con saliva fino a questa linea. Il modo per farlo è far saltare la saliva in bocca e lasciarlo passare attraverso la paglia nella fiala. Non sputare perché quello ottiene le bolle nel tuo campione - basta lasciare che la saliva esegua attraverso la paglia, ti aiuterà se non parli mentre stai facendo questo. Prova a non tirare il fegato, vogliamo solo la saliva normale Tenere d&#39;occhio la fiala della saliva e quanto è piena Se ci sono delle bolle nella parte superiore della saliva, dovrebbero andare oltre la linea, quindi c&#39;è solo saliva liquida fino alla linea. Alla lineaAlcune immagini di cibo pubblicate sul muro (PUNTA FOTO), poiché il pensiero dei cibi preferiti rende le bocche delle popolazioni d&#39;acqua &quot;. </li><li> Offrire acqua dopo che il partecipante ha completato il campione di saliva. Non consentire al partecipante di mantenere l&#39;acqua; Riprenderlo quando è finito. </li></ol> 4. Periodo di preparazione <ol><li> Dite al partecipante: &quot;In pochi minuti, vorremmo che un discorso di cinque minuti su come sei un buon amico. C&#39;è un comitato di due revisori addestrati che si trovano nella stanza accanto a cui ascoltare Al vostro discorso Il vostro compito è quello di rendere i revisori credere che tu sei un buon amico, che vogliono spiegare quali cose ti fanno un buon amico per gli altri. Sei in competizione contro molte altre persone per quanto sia bravo a dare Il tuo discorso e convincere la gente che sei un buon amico. I revisori sono esperti nel giudicare l&#39;espressione del viso e il movimento del corpo e stanno andando comParli il tuo discorso ad altre persone nello studio. Puoi notare che i revisori stanno prendendo appunti. È così che possiamo rivedere le loro note in un momento successivo. Sarai anche registrato video in modo che possiamo valutare le tue prestazioni in un secondo momento. Ora avrai 3 minuti per prepararvi al tuo discorso. Ricorda che il tuo discorso dovrebbe spiegare che cosa è di te che ti rende un buon amico e stai competendo contro altre persone per quanto sia credibile. Dopo di ciò, ti accompagnerò nella stanza accanto, dove ti metterai in mostra ai recensori e darai il tuo discorso di 5 minuti. Ci sarà un altro compito che verrà dopo il discorso, ma i revisori ti faranno sapere quale sia il compito dopo il discorso. Avete domande? Puoi scrivere note se vuoi, ma non sarai in grado di portarli in camera con te. Ok, si prega di iniziare la preparazione. Tornerò in pochi minuti. &quot; </li><li> Carta, penna e appunti per partecipare a mano per consentire loro di prendere appunti. </li><li> Lasciate solo il partecipante in camera. </li><li> Aspetta 3 minuti e poi torna in camera. </li></ol> 5. Impostazione TSST <ol><li> Dite al partecipante: &quot;Okay, è il momento di andare accanto e iniziare&quot;. Se il partecipante ha scritto note, prenderle dal partecipante. Dite: &quot; Posso prendere da voi adesso. Grazie.&quot; </li><li> Camminare il partecipante nella stanza TSST e indicare che dovrebbero affrontare i confederati e la videocamera. </li><li> Avviare la registrazione video prima che il partecipante entri nella stanza. Registra l&#39;intera attività di discorso e matematica (circa 10 minuti totali). </li><li> Avere l&#39;intervistatore giovanile introdurre il comitato. &quot;Questo è_ (nome del partecipante) _. _ (Partecipante) _, conosci una di queste persone?&quot; <ol><li> Se il partecipante non risponde, l&#39;intervistatore giovanile dice: &quot;Okay, puoi iniziare&quot;. </li><li> Se il partecipante risponde sì, hAve che il partecipante indichi chi conosce e che l&#39;intervistatore giovanile dice &quot;Ok, _ (confederato) __, ti scusi. I giudici devono essere persone che non ti conoscono &quot; . </li></ol></li></ol> 6. Task di discorso di TSST <ol><li> Il Confederato 1 afferma: &quot; Prego, dimmi perché sei un buon amico. Inizia adesso parlando .&quot; </li><li> Impostare il timer per 5 min. Avviare il timer. </li><li> Dopo 30 secondi di silenzio, utilizzare uno dei seguenti prompt per mantenere il partecipante a parlare. Utilizza i prompt per ogni sospensione di 30 secondi. <ol><li> Dite &quot;Hai ancora tempo. Continui.&quot; </li><li> Dire: &quot;Perché altro sei un buon amico?&quot; </li><li> Dite &quot;ti prego di dare un esempio quando sei stato un buon amico&quot;. </li><li> Dite &quot;Sii creativo come ti piace. Perché altro sei un buon amico?&quot; </li><li> Dopo che tutti i prompt sopra indicati sono stati utilizzati, continuare a inviare il promptRipeto con: &quot;Hai ancora tempo, continua.&quot; </li></ol></li><li> Dopo 5 minuti, il Confederate 1 dice: &quot;Si prega di fermare. Il tuo tempo è in su&quot;. (Procedere al compito matematico.) </li></ol> 7. Task di matematica TSST <ol><li> Il Confederato 1 afferma: &quot;Ora ti chiederemo di contare forte all&#39;indietro, iniziare a 423 e contare indietro verso i 7, continuare a contare indietro per 7, fino a quando non ti diciamo di fermarci. Ti mettiamo a conoscenza e ti chiediamo di ricominciare. Si prega di essere il più veloce e preciso possibile. Ora vorremmo che cominciate a contare indietro - iniziate a 423 e sottrai 7. Continuate a sottrarre i 7 a voce alta finché non ti diciamo di fermarvi. &quot; </li><li> Impostare il timer per 5 min. Avviare il timer. </li><li> Se il partecipante sembra confuso, il Confederato 1 afferma: &quot;Vuoi che lo ripeto?&quot; </li><li> Se il partecipante commette un errore, il Confederate 1 afferma: &quot;That &#39;S non corretto. Si prega di riprendere. 423 meno 7. &quot; </li><li> Se il partecipante non inizia a contare ad alta voce dopo 30 secondi, passare al seguente problema di matematica più facile, utilizzando le stesse istruzioni riportate di seguito con gli stessi suggerimenti. </li><li> Utilizzare come segue i problemi di matematica più facili (in questo ordine): 423 - 5 =? 95 - 5 =? 66 - 3 =? 6 + 3 =? </li><li> Se il partecipante si ferma dopo ogni risposta corretta per aspettare la conferma, il Confederate 1 dice: &quot;Continuate a contare indietro di 7. Correremo solo se si commette un errore, altrimenti andate avanti &quot; . </li><li> Dopo 5 minuti, i Confederate 1 dicono: &quot;Il tempo è in su. Si prega di andare accanto a dare il tuo prossimo campione di saliva.&quot; </li><li> Accompagnare il partecipante in camera solitaria. </li></ol> 8. Arrestare il protocollo <ol><li> Fornire entrambi i confederati a fermare il protocollo presto. Entrambi i confederati non sono tenuti a consultarsi tra di loro prima di farlo. </li><li> SeI partecipanti gridano o appaiono con lacrime, diventano ovviamente arrabbiati o aggressivi o altrimenti mostrano un disagio o se il partecipante inizia a posizionarsi in modo che sembra aggressivo o strano, arrestare immediatamente il protocollo, ma nel modo più normale possibile. </li><li> Dire: &quot;Il tempo è in su. Si prega di andare accanto a dare il tuo prossimo campione di saliva .&quot; </li><li> Partecipante diretto alla stanza successiva. </li></ol> 9. Campione # 2 della saliva (15 minuti di insorgenza post-stressore) <ol><li> Quando i giovani entrano nella stanza accanto, impostare il timer per 15 minuti. </li><li> Dite al partecipante: &quot;Questa è la parte più difficile della tua visita, grazie per averlo fatto e ne parleremo in un secondo momento, è il momento di raccogliere un&#39;altra saliva&quot;. </li><li> Se il partecipante menziona TSST, dica al partecipante: &quot;Possiamo parlare di questo in un minuto, ma per favore fai prima il campione della saliva. </li><li> Mettere una riga per indicare 1 ml di saliva su un crioviale da 2 ml e indicare parPartecipanti a riempire il crioviale a questa linea. Raccogli la saliva del partecipante attraverso un passone attraverso una paglia da 2 pollici nel crioviale da 2 ml 36 e congelare immediatamente (-80 ° C). </li><li> Offrire l&#39;acqua a bere dopo che il partecipante ha completato il campione di saliva. Non consentire al partecipante di mantenere l&#39;acqua; Riprenderlo quando è finito. </li></ol> 10. Debrief <ol><li> Dite al partecipante: &quot;Okay, parliamo delle attività di discorso e di matematica, forse l&#39;hai già immaginato, ma l&#39;intero scopo di queste attività è stato quello di creare lo stress, forse hai notato che i&quot; recensori &quot;non erano esattamente la più amichevole Nel mondo, giusto? &quot; &quot;Beh, prima di tutto, voglio dirti che i&quot; recensori &quot;sono solo assistenti di ricerca, il loro compito è quello di fare i ragazzi fare le attività, ma non dare alcun feedback positivo, non importa quanto sei grande.Non ha nulla a che fare con la tua prestazione su quei compiti - agiscono nello stesso modo con ogni singolo partecipante che incontrano. &quot; &quot;Probabilmente stai chiedendo perché abbiamo fatto questo. Avevamo un motivo scientifico per farlo. Stiamo studiando se la quantità di stress che sperimenta nella tua vita quotidiana influenza quanto reagi fortemente a una situazione stressante come questa. Lo studio è quello di capire perché i ragazzi reagiscono in modo diverso rispetto allo stress. Abbiamo misurato qualcosa chiamato cortisolo nei tuoi campioni saliva come un modo per vedere la tua risposta allo stress &quot;. &quot;Se hai trovato il linguaggio e la matematica stressante, non sei solo! Abbiamo scelto di fare dei discorsi e di fare matematica perché sappiamo che anche se sono sicuri di fare, rendono molte persone nervose. Necessari per fare quelle attività noi stessi, e noi tutti abbiamo trovato veramente difficile! Anche gli scienziati di Berkeley hanno messo in discussione la matematica e noi tutti dicemmo che quelli erano i longesT 10 minuti della mia vita! Ti sei sentito in questo modo? &quot; &quot;Alcune altre cose che voglio parlare ...&quot; [Se il video è stato pubblicato] &quot;Abbiamo videoregistrato questo per due motivi: il motivo principale è che i nostri capi possono assicurarsi che stiamo facendo correttamente l&#39;attività. In futuro potremmo anche guardare i video per avere maggiori informazioni sulle espressioni facciali delle persone. È solo un altro modo di vedere come gli adolescenti rispondono diversamente allo stress &quot;. Se la fotocamera non è stata realmente attivata, questa è stata un&#39;altra parte dell&#39;agente per rendere più stressante &quot;. &quot;Le persone che facevano là non stavano davvero scrivere note sulla tua performance. Stanno scrivendo solo note di sciocchezze come parte della loro recitazione. &quot;Vorremmo chiedere di non citare questa attività a qualcun altro che potrebbe essere presenteLo studio, anche se sono il tuo migliore amico, fratello, sorella, cugino o altro. Se altre persone apprendono questa attività prima di entrare per la visita, possono praticare il loro discorso in casa o essere nervosi prima di arrivare qui, e avranno un&#39;esperienza completamente diversa da quella che hai fatto. Non vogliamo che accada. Ha senso ciò? Per lo stesso motivo, se parli con i tuoi genitori, chieda loro di non dire agli amici o alla famiglia nello studio &quot;. &quot;Avete domande?&quot; </li></ol> 11. Campione # 3 della saliva (30 minuti di insorgenza post-stressore) <ol><li> Mettere una riga per indicare 1 ml di saliva su un crioviale da 2 ml e dire al partecipante di riempire il crioviale in questa linea. Raccogli la saliva del partecipante attraverso un passone attraverso una paglia da 2 pollici nel crioviale da 2 ml 36 e congelare immediatamente (-80 ° C). </li><li> Impostare il timer per 15 min. </li><li> Offrire acqua a drenareK dopo che il partecipante ha completato il campione di saliva. Non consentire al partecipante di mantenere l&#39;acqua; Riprenderlo quando è finito. </li></ol> 12. Campione # 4 della saliva (45 minuti di insorgenza post-stressore) <ol><li> Mettere una riga per indicare 1 ml di saliva su un crioviale da 2 ml e dire al partecipante di riempire il crioviale in questa linea. Raccogli la saliva del partecipante attraverso un passone attraverso una paglia da 2 pollici nel crioviale da 2 ml 36 e congelare immediatamente (-80 ° C). </li><li> Offrire l&#39;acqua a bere dopo che il partecipante ha completato il campione di saliva. Non consentire al partecipante di mantenere l&#39;acqua; Riprenderlo quando è finito. </li></ol>

There are no competing financial interests.

Lo studio attuale ha cercato di confermare l&#39;efficacia di una versione modificata del TSST con i giovani vulnerabili. Il progetto CHAMACOS ha presentato il campione ottimale per verificare l&#39;efficacia di un TSST contestualmente appropriato modificato, in quanto è univoco (i campioni messicani americani sono spesso esclusi dalla ricerca) e rappresenta un campione di giovani che hanno subito avversi di precoce malattia. I risultati confermano il successo del TSST modificato nel provocare un significativo aumento del cortisolo da campioni pre-stress a post-stress, nonché un normale recupero relativo dal TST entro il momento in cui l&#39;ultimo campione di saliva è stato raccolto. Questo studio fornisce uno strumento prezioso per il campo sia attraverso il protocollo contestualmente appropriato del TSST che un&#39;esplorazione dei fattori che hanno influenzato le modifiche del TSST originale. Ci sono diversi passi critici per l&#39;impostazione e la gestione del TSSTA cui va sottoposta. In primo luogo, entrambi i confederati devono indossare cappotti di laboratorio bianco, sedersi dietro un tavolo e avere una videocamera registrata e puntare verso dove il partecipante sarà in piedi prima che il partecipante venga portato in camera. Il partecipante è presente in tutto il TSST, mentre il comitato siede. In secondo luogo, ci deve essere 1 confederato di ogni sesso e i confederati devono essere di razza / etnia simile al partecipante e apparire di età simile al partecipante (questo studio ha usato leggermente giovani più anziani che sembrano simili in età ai partecipanti ). In terzo luogo, i confederati devono dimostrare un impatto piatto, con una leggera noia durante tutto il protocollo. I confederati devono guardare al partecipante il più possibile senza mostrare interesse durante il TSST. Confederate 2 scrive le note, mentre Confederate 1 è responsabile dell&#39;amministrazione di istruzioni e istruzioni. Va notato che condurre il TSST in un &quot;emotivo&quot;34; Lo stato prende abilità e pratica. Alcuni individui potrebbero non essere appropriati per il ruolo confederato se non sono in grado di mantenere un volto neutro. I confederati in questo studio sono stati selezionati a mano per essere in grado di mantenere la posizione neutrale durante l&#39;intero TSST. Tuttavia, se un partecipante diventa alleggerito, triste o aggressivo, questi devono sapere come e quando intervenire per fermare il protocollo. L&#39;integrità del TSST deve essere valutata periodicamente in tutto lo studio per garantire che non vi sia alcuna deriva nel comportamento emotivo o nello script. In questo studio, i controlli settimanali sono stati forniti ai confederati quando sono stati in grado di risolvere eventuali eventi insoliti con esperti in amministrazione TSST e verificare con domande. Sono stati inoltre forniti alcuni &quot;refreshers&quot; TSST ogni pochi mesi per ritrarre i confederati sul TSST. I video sono stati registrati durante il TSST per i partecipanti le cui madri hanno fornito il consenso e questi video sono stati riesaminati per garantire la veridicità dello script TSST. Infine, alcuni ricercatori possono pensare che i partecipanti che hanno espresso il tradimento o la rabbia in risposta al TSST avranno alta risposte cortisoliche. Tuttavia, questo studio ha escluso questa nozione nei dati, poiché si è rivelato che questi giovani erano più probabili essere non rispondenti ( cioè individui il cui cortisolo sia diminuito o rimasto stabile nel corso del compito) come valutato attraverso le loro reazioni di cortisolo. Pertanto, aderire ad un protocollo sensibile non ha minato i tassi di reattività complessivi, ma ha assicurato che la sfida del stressore sia stata titolata al livello appropriato per questi giovani. Il protocollo TSST standard sarebbe quindi stato inadatto sia eticamente, ma anche scientificamente, come attrito, non responsabilità e &quot;rinuncia&quot; è stata una risposta predominante. Dopo aver eseguito alcuni partecipanti tramite il TSST originale, il TSST originale è stato modificato per meglio corrispondere ai fattori contestuali di questa popolazione a causa di una risposta non ottimaleEs ( cioè , piangere, disimpegnarsi dal compito, postura aggressiva). Il personale di studio è stato consultato con numerosi ricercatori che hanno utilizzato TSST con popolazioni vulnerabili ( ad esempio , orfanotrofi, giustizia giovanile, popolazioni abusate), ma nessuna delle modifiche soddisfa perfettamente le esigenze di questo studio - alcune si sono spostate troppo lontano dal protocollo e siamo preoccupati che questi I cambiamenti non provocerebbero una risposta al cortisolo 12 , 27 . Così, nel nostro studio sono state applicate tre modifiche primarie al TSST e le modifiche e le motivazioni per queste modifiche sono illuminate di seguito. In primo luogo, è importante non alienare i partecipanti. L&#39;amministrazione di un compito di stress era importante per questo studio, ma era indispensabile che i partecipanti non venissero persi per l&#39;attrito, poiché la gioventù era stata seguita longitudinalmente da quando le loro madri sono rimaste in gravidanza con loro. In questo studio i partecipanti sono stati dEbriefed immediatamente dopo il TSST per assicurare che lo stress abbia cessato per i partecipanti dopo la conclusione del TSST. Per questo esempio, il personale che ha gestito il debriefing ha avuto bisogno di essere qualcuno più sconosciuto ma ancora empatico, senza una connessione emotiva con i giovani. Mentre ciò può sembrare controproducente, quando il personale che era familiare e emotivamente connesso alla gioventù li ha esaminati sul TSST, il giovane ha tendito ad avere più propensione verso la ruminazione sul TSST e parlare di più, che a volte si è conclusa con piangere o sentimenti di risentimento Di essere &quot;ingannato&quot;. Il personale non familiare che ha gestito il debriefing ha contribuito a garantire che non abbiamo tagliato i collegamenti longitudinali che la coorte aveva fatto con il personale familiare attuando il TSST. Questo è notato come importante all&#39;interno della comunità latino, ma è qualcosa che molti studi longitudinali che sviluppano un rapporto forte con i partecipanti dovrebbero considerare. Utilizzando sta sconosciutiFf ha anche ridotto la probabilità che il debrief servisse a sottolineare ulteriormente i giovani, dato le risposte comportamentali più ottimali che abbiamo osservato usando personale sconosciuto. Mentre il debriefing prima della raccolta di due campioni di saliva potrebbe riguardare i ricercatori che utilizzano questa modifica, va osservato che questo studio ha osservato il modello prototipo di risposta del cortisolo dopo la conclusione del TSST (con la concentrazione massima arrivata 15 minuti dopo la conclusione del stressore , E recupero 30 minuti dopo la conclusione del stressore). Questa modifica è stata fatta per essere più sensibile alla cultura verso i giovani che possono avere continuato ad avere una risposta allo stress dopo il TSST a causa del loro stato vulnerabile. In secondo luogo, il protocollo TSST deve essere flessibile per i singoli fattori del partecipante. Le giovani americane messicane in questo studio risiedono nelle comunità agricole a basso impoverimento e impoverito nella valle di Salinas. Le famiglie CHAMACOS lavorano sotto difficoltàLe condizioni, in particolare l&#39;occupazione stagionale a basso salario, intermittente e le lunghe ore di lavoro che eludono le opportunità di interazioni familiari positive durante un periodo di sviluppo rapido e saliente degli adolescenti. Stressori associati a bassa povertà / povertà nella coorte contribuiscono all&#39;insicurezza alimentare, alle abitazioni sovraffollate, alle condizioni di vita sottostanti e ai servizi medici inadeguati per affrontare le disabilità cognitive e le esigenze di salute mentale. In compenso, i giovani nella valle di Salinas sono esposti in modo sproporzionato alle turbolenze familiari e alla violenza giovanile, che sprofondano anche nelle scuole locali e nei quartieri. Questi fattori di rischio diventano sempre più accentuati quando i giovani imparano ad adattarsi alle sfide sociali ed economiche in rapida evoluzione o gradualmente diventano sensibilizzate (o in alcuni casi desensibilizzate) alla natura imprevedibile della loro vita quotidiana. Un esempio di rendere il TSST più flessibile per questa popolazione è stato quello di variare la difficoltà della sezione di matematica. Dato che questo stuDy era riservato ai test cognitivi precedenti e aveva conoscenza dell&#39;esposizione di agenti patogeni ambientali, che potrebbero influenzare l&#39;IQ 38 , era chiaro che il compito di matematica &quot;unica misura per tutti&quot; tipicamente associato al TSST non sarebbe stato in grado di ospitare questa popolazione. A seguito di altri stressori 39 , 40 , la difficoltà matematica fu pertanto titolata per essere impegnativa ma non impossibile per i giovani. In terzo luogo, il protocollo TSST deve riconoscere e costruire l&#39;alto senso della comunità e della connessione sociale all&#39;interno di determinati ambienti culturali. È importante utilizzare confederati con cui i partecipanti giovanili si connettono, quindi questo studio ha reclutato confederati leggermente più vecchi dei partecipanti in modo da apparire di etnia e etnia simili e provenienti dalla stessa comunità, quindi SET è venuto da &quot;loro pari&quot;. Al contrario, troppa connessione sociale era problematica. È importante assicurarlaI confederati sono adeguatamente neutri e che i confederati erano sconosciuti ai partecipanti. Questo è stato cruciale per lo studio in corso, perché anche se la Valle di Salinas è una regione relativamente grande, la comunità giovanile può essere molto piccola e interconnessa. Quindi, può essere utile assicurarsi prima che la TSST inizia che i partecipanti ei confederati non si conoscono. Se il partecipante o il confederato ha riconosciuto l&#39;altro in questo studio, il TSST è stato eseguito con un solo confederato. Il fatto che i confederati di questo studio provenissero dalla stessa comunità è importante da notare in questo contesto (Salinas), che è lontano da un ambiente universitario e difficile quando si trova il personale che può lavorare un&#39;ora o due alla volta. I ricercatori del campo di studio di questo studio erano molto esperti e altamente formati per quanto riguarda la ricerca, che non dovrebbe essere presa in conto per il mantenimento del protocollo. Mentre questi risultati sono promettenti per convalidare l&#39;utilizzo di un TSST modificatoCon gli adolescenti vulnerabili, è necessaria una maggiore ricerca per confermare la replicabilità di questi effetti su diversi campioni. Innanzitutto, mentre questo progetto è stato fortunato ad avere accesso ad un tale campione unico e vulnerabile di adolescenti messicani americani, questi risultati devono essere replicati in altre etnie vulnerabili per confermare che questo TSST modificato è abbastanza potente da suscitare una risposta di cortisolo Altre popolazioni. In secondo luogo, questo campione è stato limitato a 14 anni. Mentre il campionamento stretto controllato per l&#39;effetto dell&#39;età sulla risposta TSST in questo campione, la ricerca futura potrebbe tentare di replicare questi effetti in età diverse adolescenti e infantili e forse attraverso lo sviluppo puberale. Infine, va notato che i dati non sono stati raccolti da un gruppo di confronto che utilizza un TSST non modificato, in quanto sarebbe inesistente con questo esempio dato il tasso elevato di risposte povere comportamentali e emotive che stiamo riscontrando all&#39;inizio con una modifica meno Versione oIl TSST. Ci sono anche delle limitazioni della tecnica TSST in generale. Come detto in precedenza, richiede una pratica significativa per i confederati mantenere una posizione neutrale in tutto il TSST. Almeno 3 persone sono necessarie per eseguire correttamente il TSST (2 confederati e 1 sperimentatore) e il TSST funziona meglio se queste persone sono sconosciute al partecipante. Pertanto, questo protocollo è più facile da eseguire nelle impostazioni del campus universitario dove i laureati possono lavorare nel laboratorio 1-2 h alla volta, ma meno facili nelle impostazioni remote o nelle impostazioni in cui i confederati vengono pagati come lavoro (in quanto vengono pagati solo Per ~ 1 h di lavoro per TSST). Questa tecnica potrebbe anche essere un ostacolo per studi longitudinali con personale che lavora nel progetto nel tempo - questi personaggi ben noti non dovrebbero essere quelli che gestiscono il TSST. Inoltre, vi è significativo sovraccarico in termini di mantenimento dell&#39;integrità del TSST nel tempo - sono necessari esperti per esaminare il nastro videoS del TSST, gestisce i controlli settimanali con i confederati e fornisce periodiche sessioni di &quot;aggiornamento&quot; per assicurarsi che non vi sia alcuna deriva nella tecnica. Inoltre, il TSST è difficile da fare ripetutamente per un determinato partecipante, in quanto si basa su un inganno minore e i partecipanti possono abituarsi alla tecnica. Le parti del discorso e della matematica non sono controbilanciate, che sarebbero più ottimali per altre metodologie come il funzionamento del sistema nervoso autonomo. Non ci sono parti del TSST che sono non stressanti, quindi richiede un&#39;altra sessione ( cioè TSST amichevole o un TSST di placebo) o qualcos&#39;altro ( cioè un giorno di base) per avere un confronto non stress. Infine, uno stressor non basato sul laboratorio potrebbe essere più efficace ( cioè karaoke, sottobicchieri a rulli o case infestate) o più ecologiche 41 . Questo studio fornisce le basi per la ricerca futura per utilizzare un TSST modificato con i giovani vulnerabili. Futuro longitudinaleGli studi che mirano a trattenere partecipanti attraverso molteplici onde di raccolta dei dati possono anche modificare il loro approccio utilizzando alcune di queste modifiche in modo da limitare l&#39;attrito. Inoltre, questo studio dimostra che è infatti possibile creare una versione modificata del TSST sensibile alla cultura mentre titoli la reattività di stress allo stesso livello per catturare le differenze individuali nella risposta alla cortisolo.

Il test di stress sociale Trier (TSST) 1 è diventato il gold standard per indurre lo stress in ambienti di laboratorio 2 . È un stressor sociale ben validato e ampiamente utilizzato, che è stato dimostrato di indurre un aumento di 2-4 volte nel cortisolo, la produzione biologica prodotta dall&#39;asse Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) 1 , 3 . Una meta-analisi ha concluso che due aspetti fondamentali sono essenziali per indurre la reattività più potente della HPA per tutta la durata della vita: imprevedibilità / incontrollabilità e minaccia sociale valutativa (SET), entrambi caratterizzanti la TSST 3 . L&#39;adolescenza può essere un periodo di tempo fondamentale quando SET è particolarmente stressante, segnato da un periodo di sviluppo sensibile, in cui le interazioni sociali facilitano l&#39;apprendimento 4 . Ad esempio, durante la pubertà e l&#39;adolescenza precoce, l&#39;integrazione con il gruppo di pari<html> S diventa motionalmente saliente 5 . I rapidi aumenti dei livelli ormonali all&#39;inizio della pubertà influenzano lo sviluppo di circuiti limbici, che porta ad aumentare nel processo di stimoli sociali rilevanti per lo stato (ad esempio , ammirazione) come avendo aumentato la salienza motivazionale 6 . Questo aumento dell&#39;impegno sociale affettivo non influenza solo le motivazioni e i comportamenti nel momento, ma influenza anche modelli di comportamento e apprendimento motivazionale su intervalli lunghi. Nel tempo, questa variazione di priorità degli incentivi sociali può portare all&#39;esplorazione della salute e alla presa del rischio, che può promuovere l&#39;apprendimento sociale e affettivo e le competenze che sostengono il funzionamento sociale degli adulti. Quindi non sorprende che gli aspetti del funzionamento sociale coinvolti nella fase del discorso TSST siano una potente forma di stress per gli adolescenti, vale a dire l&#39;argomento &quot;buon amico&quot; 7 , 8 ,Tuttavia, gli individui sensibilizzati da una storia di traumi o da eventi stressanti di vita possono essere preparati a reagire male a situazioni valutative o imprevedibili a causa del povero controllo emotivo o della sensibilità aumentata allo stress, e questo modello di risposta negativa potrebbe contribuire a I risultati salutari negativi, come l&#39;uso di droghe o la ricerca di emozioni pericolose. Pertanto, la comprensione delle risposte biologiche a SET è di massima importanza nei giovani vulnerabili. Una manciata di studi hanno esplorato come le variazioni di SET e l&#39;incontrollabilità influenzano la responsabilità dello stress. SET può essere aumentato o diminuito in base al numero di giudici confederati. Il TSST richiede 2 confederati, ma è più efficace con quattro 10 e meno efficaci con 1 - 2 confederati 11 , 12 , 13 o con un pubblico virtuale o distante 14 , , 16 . L&#39;aggiunta di ulteriori commenti negativi aumenta le impostazioni SET e responder 11 , 17 , mentre il commento positivo riduce le tariffe SET e responder 18 . I tassi di responsabilità sono influenzati dall&#39;inversione di incontrollabilità (a) modificando la durata del tempo che i partecipanti devono preparare il discorso 14 (b) aumentare le risorse psicosociali dei partecipanti 19 , 20 , 21 , oppure (c) aumentare la fiducia in se stessi Il TSST 22 . Le modifiche che migliorano la soppressione delle emozioni 23 , la vigilanza o l&#39;attenzione sul stressore 24 , 25 , o i pensieri sull&#39;auto 26 aumentano la sensibilità TSST. Infine, il sesso e l&#39;età del conLa Federazione può influenzare la reattività di stress alla SET 27 , 28 . Questi studi illustrano che i tassi di risposta possono essere aumentati o diminuiti sperimentalmente. Nell&#39;attuale studio, il TSST è stato modificato includendo prompt di tempo, attività di matematica alternativa, utilizzo di coetanei della stessa etnia come confederati, presentazione immediata dopo la conclusione del TSST e utilizzo di un esaminatore giovanile sconosciuto per amministrare il debrief. Una recente revisione dei paradigmi del stress ha mostrato effetti particolarmente robusti della minaccia sociale valutativa sull&#39;altitudine del cortisolo (risposta HPA) durante l&#39;adolescenza media29 . Tuttavia, ci sono valide preoccupazioni circa l&#39;utilizzo del TSST con i giovani vulnerabili. In particolare, le questioni di protezione dei soggetti umani possono essere sollevate per assicurare che i benefici superino i rischi, in quanto vi è il trauma potenziale associato alla durata del TSST quando i giovani sono già vulnerabili ( ad es. </Em&gt;, provenienti da ambienti di povertà e avversità precoci). Pertanto, c&#39;è la necessità di garantire che i giovani non lasciano in uno stato di ansia o di agitazione elevata. Tuttavia, le modifiche al TSST per alleviare / mitigare alcune di queste preoccupazioni non devono ridurre l&#39;efficacia o la validità complessiva dello stressore. Ad esempio, studi precedenti hanno documentato gli effetti delle versioni modificate del TSST per i giovani vulnerabili, ma hanno avuto un limitato successo in termini di provocare un aumento del cortisolo 30 , 31 . Inoltre, potrebbe essere necessario apportare modifiche per rendere il TSST più sensibile e opportuno a livello culturale. Ad esempio, c&#39;è la letteratura che suggerisce che l&#39;interazione con individui di diverse razze può indurre reazioni di stress e di minaccia 32 . Diverso il trucco razziale del partecipante e del comitato TSST è stato dimostrato di non influire sulla reattività del cortisolo al TSST 33 , ma piuttostoRecuperare il cortisolo dal TSST 34 . Pertanto, usando confederati della stessa razza / etnia per il TSST possono eliminare qualsiasi confusione inutile della corsa dei confederati sulla minaccia stereotipata percepita e il recupero di cortisolo dal TSST. Il presente studio si è svolto nel contesto di uno studio longitudinale della coorte di nascita delle famiglie messicane americane in California chiamato Centro per la valutazione della salute delle madri e dei bambini di Salinas (CHAMACOS). Questo campione è caratterizzato come altamente vulnerabile a causa di elevati tassi di povertà (76% delle famiglie erano al di sotto o al livello della povertà federale) e un elevato numero di avvenimenti precoci avversi (numero medio di eventi di vita = 4,5 per il campione, SD = 3.3). In confronto, un grande studio retrospettivo condotto da una partnership tra i centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie e Kaiser Permanente sulla base di migliaia o degli intervistati hanno trovato solo il 13% di aver riportato 4 o più chi avversiEventi ldhood 35 . Il TSST è stato somministrato ai giovani in questo studio come parte di una grande sovvenzione NIH volta a ricercare il legame tra eventi avversi di precoce vita, reattività biologica alla minaccia sociale valutativa all&#39;età di 14 anni (quando è stata somministrata la TSST) e comportamenti di rischio (All&#39;età di 16 anni, la raccolta dei dati è ancora in corso; grant1R01DA035300). Durante le prime fasi di pilotaggio del TSST, abbiamo osservato che l&#39;approccio doveva essere spostato per diventare sensibili contestualmente alle esigenze uniche di questa popolazione e ad attenuare le scarse risposte ( vale a dire piangere, arrabbiarsi, disattivare dal TSST). Per essere precisi, abbiamo avuto una percentuale del 20% di scarse reazioni comportamentali al TSST prima delle modifiche ( cioè 4 dei 20 partecipanti TSST hanno pianto o risposto con rabbia), mentre solo il 5% ha risposto con scarse risposte dopo le modifiche. Il personale di studio era altrettanto consapevole dell&#39;importanza della retaIn questo studio longitudinale. Va notato che durante la fase pilota, gli individui che hanno risposto al TSST con reazioni stressistiche estreme in modo comportamentale durante il colloquio erano, a livello biologico, &quot;non rispondenti&quot;, cioè non hanno dimostrato un aumento del cortisolo. Questa giustapposizione emozionale / biologica da questi risultati iniziali ha anche evidenziato la necessità di modificare il TSST per creare le condizioni ottimali per indurre una risposta biologica appropriata al TSST. Quindi, questo studio fornisce prove preliminari da un sottoinsieme di giovani dell&#39;efficacia del TSST modificato per indurre la reattività della cortisolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">TSST</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 white lab coats</td>
			<td>Dickies</td>
			<td>83403</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 clip boards</td>
			<td>Staples</td>
			<td>21423</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 pens</td>
			<td>BIC</td>
			<td>GSM609-Blk</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>B00EYU3E7I</td>
			<td>For confederates to sit behind</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video Camera &#38; Tripod</td>
			<td>Sony</td>
			<td>K-86674-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paper&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>For participant&#39;s preparation period</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saliva samples</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latex gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19041171C</td>
			<td>To collect saliva samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 mL cryovials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W985872-100</td>
			<td>4 per participant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80 C freezer</td>
			<td>So-Low</td>
			<td>U85-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#39;&#39; straws&#160;</td>
			<td>Genuine Joe</td>
			<td>GJO58925</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified trier social stress test for vulnerable mexican american adolescents

Il test di stress sociale di Trier (TSST) è un stressor sociale ben convalidato e ampiamente utilizzato che è stato dimostrato di indurre un aumento di 2-4 volte nel cortisolo, la produzione biologica prodotta dall&#39;asse Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) negli esseri umani. Mentre gli studi hanno esplorato come le modifiche alla TSST influenzano la responsabilità dello stress, pochi studi hanno creato un TSST modificato appropriato per i giovani vulnerabili che provoca una significativa risposta allo stress del cortisolo. Pertanto, lo studio attuale ha cercato di modificare o modificare il TSST in modo culturalmente sensibile per un campione vulnerabile di adolescenti di 14 anni. Il presente studio si è svolto nel contesto di uno studio longitudinale della coorte di nascita delle famiglie messicane americane in California chiamato Centro per la valutazione della salute delle madri e dei bambini di Salinas (CHAMACOS). Il campione di CHAMACOS era ottimale per testare l&#39;efficacia di un TSST modificato in modo culturale, in quanto è composto da giovani americani messicani che sono diDieci esclusi dalla ricerca. Questi giovani hanno anche sperimentato avversità precoci di vita. Le modifiche all&#39;esempio includevano i suggerimenti temporizzati, le attività di matematica alternative, l&#39;uso di coetanei della stessa etnia come i confederati, il debriefing immediatamente dopo la conclusione del TSST e l&#39;utilizzo di un esaminatore giovanile sconosciuto per amministrare il debrief. I campioni della saliva sono stati raccolti alla base di base (dopo una fase di riposo) e poi di nuovo a 15, 30 e 45 minuti post-TSST per valutare la concentrazione di cortisolo. Uno studio pilota di 50 partecipanti (50% femminili) è stato analizzato per la reazione di cortisolo al TSST. I risultati hanno confermato che questa versione modificata del TSST ha avuto successo nell&#39;elezione di una reazione cortisolica significativa, con un&#39;ampia gamma di variabilità probabilmente dovuta alle differenze individuali. Sono discussi gli obiettivi per le modifiche e le considerazioni di etnia. Questo studio fornisce le basi per la ricerca futura per utilizzare un TSST modificato con i giovani vulnerabili.

Il campione è composto da 14 anni che sono stati parte di uno studio di coorte molto ricercato e stabilito, il Centro per la valutazione della salute delle madri e dei bambini di Salinas (CHAMACOS). Questo studio è costituito dalla prima coorte di 325 famiglie messicane americane che vivono in una comunità di agricoltori in California e hanno seguito prospetticamente perché erano in utero. Il TSST non è stato somministrato alla seconda coorte CHAMACOS di 300 bambini seguita dall&#39;età di 9 anni. Gli adolescenti sono stati sottoposti a screening per partecipare al TSST se il loro QI di scala totale era &lt;70 da una visita precedente (12 anni), se l&#39;adolescente era mai diagnosticato con autismo per rapporto materno, se i comportamenti atipici estremi mostrati in clinica nelle visite passate ( vale a dire Diffidenza / paranoia sullo studio, vedere le cose o le persone che non sono lì - per relazione materna), se il loro punteggio di screener della depressione era ≥3 SD superiori alla media per l&#39;età e il sesso e se tL&#39;adolescente ha riferito di essere coinvolto in una lotta di gang nell&#39;anno precedente. Questi criteri di esclusione sono stati aggiunti sulla base di over-responding inizialmente al TSST, ma non è chiaro se questi criteri di esclusione hanno fatto la differenza nei risultati finali. Oltre a questi criteri di esclusione, i partecipanti sono stati iscritti indipendentemente dalla loro salute psicologica e fisica. Alla fine, 264 adolescenti completarono il TSST in pieno con o nessun problema segnalato o nessun problema fino al debrief. La tabella 1 elenca il numero di partecipanti esclusi e perché sono stati esclusi. Non c&#39;erano differenze demografiche tra coloro che completarono e non completarono il TSST. I campioni di saliva sono stati conservati a -80 ° C fino a quando non sono stati spediti su ghiaccio secco ai colleghi della Iowa State University ( cioè il laboratorio di biosicurezza II). All&#39;arrivo, i campioni di saliva congelati sono stati catalogati e riposti in un congelatore -80 ° C. SopraIl giorno del saggio, ciascun campione di saliva fu scongelato e saggiato entro 24 ore in duplice esemplare usando kit di immunoassay enzimatici altamente sensibili. I coefficienti mediali di variazione (CV) del medesimo media erano inferiori al 2,25% e il calibro di inter-assay medio era del 5,13% per il cortisolo. Il campione è stato riesaminato se il CV per le misurazioni duplicate era superiore al 7%. Le statistiche descrittive per le misure di cortisolo e le deviazioni standard per ogni campione sono fornite nella tabella 2 e rappresentate in figura 1 . A 2 x 4 misure ripetute ANOVA è stato eseguito per testare gli effetti del sesso sui quattro campioni saliva. C&#39;è stato un effetto principale per la risposta del cortisolo al TSST ( F = 9.09, p &lt;0.001), ma il sesso non era un predittore significativo della risposta del cortisolo allo stress ( F = 1.03, p = .39). L&#39;indice di massa corpore media è stato di 23.53, e non era anche un predittore significativo della ripetizioneLe misure di cortisolo ANOVA ( F = 1,03, p = 0,38). Come previsto, i campioni di t-test dei campioni associati (riportati nella Tabella 3 ) hanno rivelato significativi cambiamenti nel cortisolo dal pre-stress a 15 minuti di insorgenza post-stressore, da 15 minuti dopo l&#39;insorgenza del post-stressore a 30 minuti dall&#39;insorgenza post-stressore e da 30 min post-stressore a 45 min post-stressore. La maggiore variazione del cortisolo si è verificata quando si confronta la concentrazione di cortisolo pre-stress alla concentrazione post-stressor di 30 minuti, coerente con la ricerca precedente (Cohen&#39;s = .80) 1 , 3 . Gli individui che sono stati contrassegnati come avere un tempo difficile con il TSST tendevano a riportare una maggiore reattività alla stress allo stress, ma riportarono di tornare ad uno stato normale prima della fine dello studio. Mentre la concentrazione post-stressina di 30 minuti era la concentrazione più alta di questi campioni, la concentrazione di cortisolo post-stressor di 45 minuti suggerisce che gli individui iniziaronoPer recuperare dal stressore, poiché la concentrazione post-stressor di 45 minuti era significativamente inferiore alla concentrazione di 30 minuti (vedi tabella 3 ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393fig1.jpg" /> Figura 1: Reattività del cortisolo al TSST. La reattività della cortisol è caratterizzata da deviazioni standard. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55393/55393fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393table1.jpg" /> Tabella 1: Motivi di esclusione. I partecipanti sono stati esclusi dallo studio se hanno avviato il TSST, ma si sono fermati presto, hanno rifiutato di partecipare, sono stati proiettati fuori del progetto o sono stati ignorati a causa di problemi relativi al progetto. Tabella 2: Concentrazioni medie di cortisolo e deviazioni standard. Il cortisolo è aumentato dai campioni 1-3 e quindi diminuito dal campione 4. <img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/55393/55393table3.jpg" /> Tabella 3: test t-campioni in coppia. Confronta i campioni l&#39;uno all&#39;altro nella concentrazione di cortisolo (μg / dL) e deviazioni standard (SD) per il cambiamento di cortisolo. Gli aumenti significativi del cortisolo sono stati osservati dal campione di base ai campioni post-stress.

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A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

Qui presentiamo un protocollo che ha provocato la reattività della cortisolo in un campione messicano adolescente vulnerabile americano usando una versione modificata del Trier Social Stress Test (TSST). Campioni di saliva sono stati raccolti a basale, 15, 30 e 45 minuti post-TSST. La ricerca futura potrebbe utilizzare questo TSST modificato con giovani vulnerabili.

Un test di stress sociale modificato di Trier per adolescenti americani messicani vulnerabili

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

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12.7K Views.  University of California, Berkeley.  Qui presentiamo un protocollo che ha provocato la reattività della cortisolo in un campione messicano adolescente vulnerabile americano usando una versione modificata del Trier Social Stress Test (TSST). Campioni di saliva sono stati raccolti a basale, 15, 30 e 45 minuti post-TSST. La ricerca futura potrebbe utilizzare questo TSST modificato con giovani vulnerabili. 

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.