Os autores agradecem aos pais e adolescentes que participaram do estudo CHAMACOS. Também agradecemos a equipe da CHAMACOS que trabalhou no estudo, especialmente Katherine Kogut, MS, por todo o trabalho que fez como gerente de projeto para este estudo. Os autores também gostariam de reconhecer a concessão do Instituto Nacional de Abuso de Drogas 1R01DA035300.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Berkeley e da Universidade da Califórnia, em São Francisco. Os participantes estavam programados para chegar ao laboratório entre as 4:30 às 5:00 da manhã. 1. Enxaguar a boca <ol><li> Peça ao participante para ir ao banheiro e enxaguar a boca com água apenas. Peça ao participante que se abaixe com água fria por 5-10 s e cuspir na pia. Faça isso apenas uma vez. </li><li> Diga ao participante: &quot;Isso é para garantir que não haja alimentos ou migalhas nos dentes para a coleta de saliva&quot;. </li></ol> 2. Período de descanso <ol><li> Participante Usher em uma sala solitária e permitir que eles se sentam por pelo menos 10 min. Peça aos participantes que completem questionários não invasivos ou não provocativos, como uma folha de informações de contato e questionários de vida diária, bem como assistam um vídeo pacifico de vida marinha de 3 min. </li></ol> 3. Coleção Saliva # 1 (PRe-stress) <ol><li> Coloque uma linha para indicar 1 mL de saliva em um criovial de 2 mL e diga ao participante que preencha o criovial nesta linha. Colete a saliva do participante através de baba passiva através de uma palha de duas polegadas no 2 ml criovial 36 e congelar imediatamente (-80 ° C). </li><li> Diga ao participante: &quot; Eu pedirei que você coloque este frasco com saliva até esta linha. A maneira de fazê-lo é deixar a saliva coletar na boca e depois deixá-la percorrer a palha para o frasco. É melhor se você Não cuspir porque isso faz bolhas na sua amostra - basta deixar a saliva atravessar a palha. Isso ajudará se você não conversar enquanto estiver fazendo isso. Por favor, tente não tossir fleuma, só queremos saliva normal . Fique atento ao seu frasco de saliva e quão cheio estiver. Se houver bolhas no topo da sua saliva, eles devem passar pela linha, então há apenas saliva líquida até a linha. Diga-me quando se enche Para a linha. Aqui umHá algumas fotos de alimentos postadas na parede (POINT OUT PICTURES), uma vez que pensar em alimentos favoritos faz com que a boca das pessoas seja aquosa &quot;. </li><li> Ofereça água após o participante completar a amostra de saliva. Não permita que o participante mantenha a água; Retomá-lo quando ele / ela terminar. </li></ol> 4. Período de preparação <ol><li> Diga ao participante: &quot;Em poucos minutos, gostaríamos que você dê um discurso de cinco minutos sobre como você é um bom amigo. Existe um comitê de dois revisores treinados que estão no quarto ao lado que vão estar ouvindo Para o seu discurso. Seu trabalho é fazer com que os críticos acreditam que você é um bom amigo. Eles querem que você explique o que as coisas fazem de você um bom amigo para os outros. Você está competindo contra muitas outras pessoas para o quão bom você está dando Seu discurso e convence as pessoas de que você é um bom amigo. Os revisores são especialistas em julgar a expressão facial e o movimento do corpo, e eles vão comPare seu discurso para outras pessoas no estudo. Você pode notar que os revisores estão tomando notas. Isto é para que possamos rever suas anotações mais tarde. Você também será filmado para que possamos avaliar seu desempenho mais tarde. Você terá 3 minutos agora para se preparar para o seu discurso. Lembre-se, seu discurso deve explicar o que é sobre você que o torna um bom amigo, e você está competindo contra outras pessoas por quão crível você é. Depois disso, vou levá-lo para a próxima sala, onde você se apresentará aos revisores e dará seu discurso de 5 minutos. Haverá outra tarefa que vem após o discurso, mas os revisores vão deixar você saber qual é a tarefa após o discurso. Você tem alguma pergunta? Você pode escrever notas se quiser, mas você não poderá levá-las para o quarto com você. Ok, comece a preparar. Eu voltarei em alguns minutos. &quot; </li><li> Participe papel, caneta e prancheta para permitir que eles tomem notas. </li><li> Deixe o participante sozinho na sala. </li><li> Aguarde 3 min e volte no quarto. </li></ol> 5. Configuração TSST <ol><li> Diga ao participante: &quot;Ok, é hora de ir ao lado e começar&quot;. Se o participante tiver escrito notas, leve-as do participante. Diga: &quot; Posso tirar aqueles de você agora. Obrigado&quot;. </li><li> Passe o participante para a sala TSST e indique que eles devem enfrentar os confederados e a câmera de vídeo. </li><li> Inicie a gravação de vídeo antes que o participante entre na sala. Registre todas as tarefas de fala e matemática (aproximadamente 10 minutos no total). </li><li> Peça ao entrevistador da juventude que apresente o comitê. &quot;Este is_ (nome do participante) _. _ (Participante) _, você conhece essas pessoas?&quot; <ol><li> Se o participante responder não, peça ao entrevistador da juventude que diga &quot;Ok, você pode começar&quot;. </li><li> Se o participante responder sim, hO Participante indique quem ele / ela conhece e peça ao entrevistador da juventude que diga &quot;Ok, _ (confederado) __, desculpe-se. Os juízes precisam ser pessoas que não o conhecem &quot; . </li></ol></li></ol> 6. TSST Speech Task <ol><li> Confederate 1 diz: &quot; Diga-nos por que você é um bom amigo. Comece a falar agora &quot;. </li><li> Ajuste o temporizador por 5 min. Temporizador de início. </li><li> Após 30 s de silêncio, use uma das seguintes instruções para manter o participante falando. Use prompts para cada vez que houver uma pausa de 30 s. <ol><li> Diga &quot;Você ainda tem tempo. Por favor continue&quot;. </li><li> Diga &quot;Por que você é um bom amigo?&quot; </li><li> Diga &quot;Por favor, dê um exemplo de quando você era um bom amigo&quot;. </li><li> Diga &quot;Seja tão criativo quanto você quiser. Por que você é um bom amigo?&quot; </li><li> Depois de todas as instruções acima foram usadas, continue a solicitar oDepois, com &quot;Você ainda tem tempo. Por favor, continue&quot;. </li></ol></li><li> Após 5 minutos, confederar 1 diz: &quot;Pare com o seu tempo&quot;. (Proceda à tarefa de matemática.) </li></ol> 7. TSST Tarefa Matemática <ol><li> Tenha o Confederate 1 dizer: &quot;Agora vamos pedir que você conta em alto para trás. Comece em 423 e conte o atraso em 7. Continue contando para trás por 7 em voz alta até que nós lhe digamos para parar. Se você cometer um erro, nós Irá deixar você saber e pedir-lhe para começar de novo. Seja o mais rápido e preciso possível. Agora, gostaríamos que você comecesse contando para trás - comece em 423 e subtraia 7. Continue a subtrair 7 em alto até que nós lhe digamos para parar. &quot; </li><li> Ajuste o temporizador por 5 min. Temporizador de início. </li><li> Se o participante parece confuso, peça ao Confederate 1: &quot;Você gostaria que eu repetasse isso?&quot; </li><li> Se o participante cometeu um erro, peça ao Confederate 1, &quot;That&quot;É incorreto. Comece novamente. 423 menos 7. &quot; </li><li> Se o participante não começar a contar alto alto após 30 s, mude para o próximo problema de matemática mais fácil, usando as mesmas instruções acima com os mesmos avisos. </li><li> Use o seguinte, pois os problemas de matemática mais fáceis incluem (nesta ordem): 423 - 5 =? 95 - 5 =? 66 - 3 =? 6 + 3 =? </li><li> Se o participante parar após cada resposta correta para aguardar a confirmação, confira 1 diga: &quot;Continue contando para trás em 7. Nós apenas corrigiremos você se cometer um erro - caso contrário, continue &quot; . </li><li> Depois de 5 min, confederar 1 diz: &quot;O tempo acabou. Por favor, vá ao lado para dar sua próxima amostra de saliva&quot;. </li><li> Acompanhante o participante de volta ao quarto solitário. </li></ol> 8. Parar Protocolo <ol><li> Permitir que ambos os confederados detenham o protocolo cedo. Ambos os confederados não são obrigados a consultar uns com os outros antes de fazê-lo. </li><li> E seO participante chora ou aparece com olhos com lágrimas, torna-se obviamente irritado ou agressivo, ou de outra forma mostra sofrimento ou se o participante começa a postura de uma maneira que parece agressiva ou impar, pare o protocolo imediatamente, mas o mais normalmente possível. </li><li> Diga: &quot; Time&#39;s Up. Por favor, vá ao lado para dar sua próxima amostra de saliva &quot;. </li><li> Participante direto para a próxima sala. </li></ol> 9. Amostra # 2 de saliva (15 minutos após início pós-estressor) <ol><li> Quando o jovem voltar a entrar na próxima sala, ajuste o temporizador durante 15 min. </li><li> Diga ao participante: &quot;Essa é a parte mais difícil da sua visita, obrigado por fazer isso e vamos falar sobre isso em um segundo. É hora de colecionar outra saliva&quot;. </li><li> Se o participante menciona a TSST, diga ao participante: &quot;Podemos conversar sobre isso em um minuto, mas primeiro faça a amostra de saliva. </li><li> Coloque uma linha para indicar 1 mL de saliva em um criovial de 2 mL e digaPara preencher o criológico para esta linha. Colete a saliva do participante através de baba passiva através de uma palha de duas polegadas no 2 ml criovial 36 e congelar imediatamente (-80 ° C). </li><li> Ofereça água para beber após o participante ter completado a amostra de saliva. Não permita que o participante mantenha a água; Retomá-lo quando ele / ela terminar. </li></ol> 10. Debrief <ol><li> Diga ao participante: &quot;Ok, vamos conversar sobre as atividades de fala e matemática. Você pode ter adivinhado isso, mas o objetivo dessas atividades foi criar estresse. Você pode ter percebido que os&quot; revisores &quot;não eram exatamente os mais amigáveis No mundo, certo? &quot; &quot;Bem, antes de tudo, eu quero dizer-lhe que os&quot; revisores &quot;são apenas assistentes de pesquisa. Seu trabalho é fazer que os adolescentes façam as atividades, mas não dão comentários positivos, não importa o quão genial você faça. Então, seu comportamento láNão há nada a ver com o seu desempenho nessas tarefas - eles agem da mesma forma com cada participante que eles conhecem. &quot; &quot;Você provavelmente está se perguntando por que nós fizemos isso. Tivemos uma razão científica para fazê-lo. Estamos estudando se a quantidade de estresse que você experimenta em sua vida diária afeta o quão fortemente você responde a uma situação estressante como essa. Um ponto de O estudo é entender por que os adolescentes reagem de forma diferente ao estresse. Estávamos medindo algo chamado cortisol em suas amostras de saliva como forma de ver sua resposta ao estresse &quot;. &quot;Se você achou o discurso e as matemáticas estressantes, você não está sozinho! Nós escolhemos fazer discursos e fazer matemática, porque sabemos que, embora sejam seguras de fazer, eles fazem muita gente nervosa. Deixe-me dizer-lhe, nós Precisávamos fazer essas atividades nós mesmos, e todos achamos isso realmente difícil! Mesmo os cientistas de Berkeley dissiparam a matemática. E todos dissemos &#39;esses foram os longosT 10 minutos da minha vida! Você se sentiu assim? &quot; &quot;Mais algumas coisas que eu quero mencionar ...&quot; [SE VIRIDO NO VÍDEO] &quot;Nós filmamos isso por 2 razões. O motivo principal é que nossos chefes possam se certificar de que NÓS estamos fazendo a atividade corretamente. No futuro, também podemos olhar para os vídeos para obter mais informações sobre as expressões faciais das pessoas. É apenas uma outra maneira de ver como os adolescentes respondem de forma diferente ao estresse &quot;. [SE NÃO É VIDEOTAPADO] &quot;A verdade é que não estávamos gravando você. A câmera não estava ativada. Esta era outra parte da atuação para torná-la mais estressante&quot;. &quot;As pessoas lá não estavam realmente escrevendo notas sobre seu desempenho. Eles estavam apenas escrevendo notas absurdas como parte de sua atuação. &quot;Nós gostaríamos de pedir que você não mencionasse esta atividade para qualquer outra pessoa que pudesse estar emO estudo, mesmo que sejam seu melhor amigo, irmão, irmã, primo ou o que quer que seja. Se outras pessoas aprendem sobre essa atividade antes de entrarem na visita, podem praticar seu discurso em casa ou ficam nervosas antes mesmo de chegarem aqui, e terão uma experiência totalmente diferente do que você acabou de fazer. Nós não queremos que isso aconteça. Isso faz sentido? Pelo mesmo motivo, se você conversar com seus pais sobre isso, peça-lhes que não digam aos amigos ou familiares no estudo &quot;. &quot;Você tem alguma pergunta?&quot; </li></ol> 11. Amostra de saliva n. ° 3 (início pós-estressor de 30 min) <ol><li> Coloque uma linha para indicar 1 mL de saliva em um criovial de 2 mL e diga ao participante que preencha o criovial nesta linha. Colete a saliva do participante através de baba passiva através de uma palha de duas polegadas no 2 ml criovial 36 e congelar imediatamente (-80 ° C). </li><li> Programe o temporizador por 15 min. </li><li> Ofereça água para drinK após o participante ter completado a amostra de saliva. Não permita que o participante mantenha a água; Retomá-lo quando ele / ela terminar. </li></ol> 12. Amostra de saliva n. ° 4 (45 minutos, pós-estressor) <ol><li> Coloque uma linha para indicar 1 mL de saliva em um criovial de 2 mL e diga ao participante que preencha o criovial nesta linha. Colete a saliva do participante através de baba passiva através de uma palha de duas polegadas no 2 ml criovial 36 e congelar imediatamente (-80 ° C). </li><li> Oferecer água para beber após o participante ter completado a amostra de saliva. Não permita que o participante mantenha a água; Retomá-lo quando ele / ela terminar. </li></ol>

There are no competing financial interests.

O presente estudo procurou confirmar a eficácia de uma versão modificada do TSST com jovens vulneráveis. O projeto CHAMACOS apresentou a amostra ideal para testar a eficácia de um TSST contextualmente apropriado, pois é único (as amostras mexicano-americanas são muitas vezes excluídas da pesquisa) e representa uma amostra de jovens que sofreram adversidade significativa da vida precoce 37 . Os resultados confirmam o sucesso do TSST modificado para provocar um aumento significativo do cortisol das amostras pré-estresse para pós-estresse, bem como uma recuperação relativa normal da TSST no momento em que a última amostra de saliva foi coletada. Este estudo fornece uma valiosa ferramenta para o campo através do protocolo contextualmente apropriado do TSST, bem como uma exploração dos fatores que influenciaram as modificações da TSST original. Existem várias etapas críticas para a configuração e administração do TSSTQue deve ser atendido. Primeiro, ambos os confederados precisam usar blusões de laboratório brancas, sentar-se atrás de uma mesa e gravar uma câmera de vídeo e apontar para onde o participante estará em pé antes que o participante seja introduzido na sala. O participante fica em toda a TSST, enquanto o comitê se senta. Em segundo lugar, é necessário que haja 1 confederado de cada sexo, e os confederados precisam ser de raça / etnia similar ao participante e que aparecem de idade semelhante ao participante (este estudo utilizou jovens ligeiramente mais velhos que pareciam semelhantes em idade aos participantes ). Em terceiro lugar, os confederados devem demonstrar um efeito plano, com um leve tédio ao longo do protocolo. Os confederados devem olhar para o participante o máximo possível sem mostrar interesse durante o TSST. Confederate 2 escreve notas, enquanto o Confederate 1 é responsável por administrar prompts e instruções. Deve-se notar que a realização do TSST de forma emocionalmente &quot;neutra e #34; O estado requer habilidades e práticas. Alguns indivíduos podem não ser apropriados para o papel confederado se eles não conseguirem manter um rosto neutro. Os confederados neste estudo foram selecionados manualmente para poder manter a posição neutra durante toda a TSST. No entanto, se um participante se tornar lágrima, triste ou agressivo, esse pessoal precisa saber como e quando intervir para interromper o protocolo. A integridade do TSST também precisa ser avaliada periodicamente ao longo do estudo para garantir que não haja deriva no comportamento emocional ou no roteiro. Neste estudo, os check-ins semanais foram fornecidos aos confederados quando puderam solucionar quaisquer ocorrências incomuns com especialistas na administração do TSST e verificar as questões. TSST &quot;refreshers&quot; também foi fornecido a cada poucos meses para treinar os confederados no TSST. Os vídeos foram gravados durante o TSST para participantes cujas mães forneceram consentimento e esses vídeos foram revisados ​​para garantir a veracidade do script TSST. Finalmente, alguns pesquisadores podem pensar que os participantes que expressaram traição ou raiva em resposta ao TSST terão altas respostas de cortisol. No entanto, este estudo descartou essa noção nos dados, pois revelou que esses jovens eram mais prováveis ​​de ser não respondedores ( ou seja , indivíduos cujo cortisol diminuiu ou permaneceu estável em toda a tarefa), conforme avaliado através de suas reações de cortisol. Assim, a adesão estrita a um protocolo sensível não prejudicou as taxas globais de reatividade, mas assegurou que o desafio do estressor fosse atribuído ao nível apropriado para esses jovens. O protocolo TSST padrão teria, portanto, sido inadequado tanto éticamente como também cientificamente, pois o atrito, a não resposta e o &quot;abandono&quot; eram uma resposta predominante. Depois de executar alguns participantes através do TSST original, o TSST original foi modificado para combinar melhor os fatores contextuais desta população devido à resposta não ótimaEs ( ou seja , choro, desengate da tarefa, postura agressiva). O pessoal de estudo consultou numerosos pesquisadores que usaram o TSST com populações vulneráveis ​​( p . Ex. , Orfanatos, contextos de justiça juvenil, populações maltratadas), mas nenhuma das modificações adequa-se perfeitamente às necessidades deste estudo - alguns se desviaram muito do protocolo e nos preocupava que estes As mudanças não provocariam uma resposta do cortisol 12 , 27 . Assim, três modificações primárias foram aplicadas ao TSST em nosso estudo, e as modificações e motivações para essas modificações são iluminadas abaixo. Primeiro, é importante não alienar os participantes. A administração de uma tarefa de estresse foi importante para este estudo, mas era imperativo que os participantes não estivessem perdidos por atrito, já que os jovens foram seguidos longitudinalmente desde que suas mães ficaram grávidas com eles. Neste estudo, os participantes foram dEbriefed imediatamente após o TSST, a fim de garantir que o estresse tenha cessado para os participantes após a conclusão da TSST. Para esta amostra, a equipe que administrava o esclarecimento precisava ser alguém tão desconhecido quanto possível, mas ainda empático, sem uma conexão emocional com a juventude. Embora isso possa parecer contra-intuitivo, quando os funcionários que estavam familiarizados e emocionalmente conectados com os jovens os informaram sobre o TSST, os jovens tendiam a ter mais propensão à ruminação sobre o TSST e falando mais sobre isso, que às vezes terminava com choro ou sentimento de ressentimento Para ser &quot;enganado&quot;. A equipe desconhecida que administrava o esclarecimento ajudou a garantir que não tivéssemos cortado as conexões longitudinais que a coorte fizera com a equipe familiar implementando a TSST. Isto é notado como importante dentro da comunidade latina, mas é algo que muitos estudos longitudinais que desenvolvam um forte relacionamento com os participantes devem ser considerados. Usando staAlém disso, reduziu a probabilidade de o esclarecimento servir para enfatizar ainda mais a juventude, atendendo às respostas comportamentais mais ótimas que observamos usando pessoal desconhecido. Embora o esclarecimento antes da coleta de mais duas amostras de saliva possa se relacionar com pesquisadores usando esta modificação, deve-se notar que este estudo observou o padrão prototípico de resposta ao cortisol após a conclusão do TSST (com maior concentração chegando 15 min após a conclusão do estressor E recuperação 30 min após a conclusão do estressor). Esta modificação foi feita para ser mais culturalmente sensível aos jovens que podem ter continuado a ter uma resposta ao estresse após o TSST devido ao seu estado vulnerável. Em segundo lugar, o protocolo TSST precisa ser flexível para os fatores individuais do participante. A juventude mexicano-americana neste estudo reside em comunidades agrícolas de baixo recursos e empobrecidas no Vale das Salinas. As famílias CHAMACOS trabalham sob dificuldadeCondições, especialmente empregos sazonais intermitentes e de baixa remuneração e horários de trabalho longos que contornam oportunidades de interações familiares positivas durante um período de desenvolvimento rápido e saliente nos adolescentes. Os estressores associados à baixa SES / pobreza na coorte contribuem para a insegurança alimentar, habitação superlotada, condições de vida precárias e serviços médicos inadequados para abordar deficiências cognitivas e necessidades de saúde mental. Considerando que isso é que a juventude no Vale dos Salinas está exposta desproporcionalmente à turbulência familiar e à violência juvenil, que se espalham para escolas e bairros locais. Estes fatores de risco tornam-se cada vez mais acentuados, já que os jovens aprendem a se adaptarem a desafios sociais e econômicos em rápida mudança ou gradualmente se tornam sensibilizados (ou, em alguns casos, desensibilizados) para a natureza imprevisível de suas vidas diárias. Um exemplo de tornar o TSST mais flexível para essa população era variar a dificuldade da seção de matemática. Dado que este estudoDy estava familiarizado com os testes cognitivos anteriores e tinha conhecimento da exposição ao patógeno ambiental, o que pode afetar o QI 38 , ficou claro que a tarefa de matemática &quot;um tamanho de todos&quot; tipicamente associada ao TSST não iria acomodar esta população. Após outros estressores 39 , 40 , a dificuldade matemática foi, portanto, titulada para ser desafiadora, mas não impossível para os jovens. Em terceiro lugar, o protocolo TSST precisa reconhecer e construir sobre o alto senso de conexão social e comunidade dentro de determinadas configurações culturais. É importante usar confederados com os quais os participantes da juventude se conectam, pelo que este estudo recrutou confederados ligeiramente mais velhos do que os participantes, de modo a aparecer de idade e etnia similar, e vieram da mesma comunidade, então SET veio de &quot;seus pares&quot;. Por outro lado, muita conexão social era problemática. É importante garantir queOs confederados são adequadamente neutros e os confederados eram desconhecidos para os participantes. Isso foi crítico para o estudo atual porque, embora o Salinas Valley seja uma região relativamente grande, a comunidade juvenil pode ser muito pequena e interconectada. Assim, pode ser útil garantir antes que o TSST comece que os participantes e confederados não se conheçam. Se o participante ou o confederado reconheceram o outro neste estudo, o TSST foi executado com apenas um confederado. O fato de que os confederados deste estudo vieram da mesma comunidade é importante observar neste contexto (Salinas), que está longe de ser um ambiente universitário e difícil ao encontrar funcionários que podem trabalhar uma hora ou duas por vez. Os pesquisadores do escritório de campo deste estudo foram muito experientes e altamente treinados em relação à pesquisa, o que não deve ser considerado como garantido em termos de manutenção do protocolo. Embora esses resultados sejam promissores para validar o uso de um TSST modificadoCom adolescentes vulneráveis, é necessária mais pesquisa para confirmar a replicabilidade desses efeitos em diferentes amostras. Primeiro, enquanto este projeto teve a sorte de acessar uma amostra tão singular e vulnerável de adolescentes mexicano-americanos, esses resultados precisam ser replicados em outras etnias vulneráveis ​​para confirmar que esta TSST modificada é suficientemente potente para provocar uma resposta de cortisol em Outras populações. Em segundo lugar, esta amostra foi limitada a 14 anos de idade. Enquanto a amostragem estreita controlada pelo efeito da idade na resposta TSST nesta amostra, pesquisas futuras poderiam tentar replicar esses efeitos em diferentes idades adolescentes e crianças, e talvez em todo o desenvolvimento puberal. Finalmente, deve-se notar que os dados não foram coletados de um grupo de comparação utilizando um TSST não modificado, pois não seria ético com essa amostra, dada a alta taxa de respostas comportamentais e emocionais pobres que experimentávamos no início com uma modificação menos modificada Versão oO TSST. Existem também limitações da técnica TSST em geral. Como mencionado anteriormente, é necessário uma prática significativa para os confederados manterem a posição neutra em toda a TSST. Pelo menos 3 pessoas são necessárias para executar o TSST adequadamente (2 confederados e 1 experimentador), e o TSST corre melhor se essas pessoas forem desconhecidas para o participante. Assim, este protocolo é mais fácil de executar nas configurações do campus da faculdade, onde estudantes de graduação podem trabalhar no laboratório 1-2 h de cada vez, mas menos fácil em configurações remotas ou em configurações onde os confederados estão sendo pagos como um trabalho (como eles são pagos apenas Por ~ 1 h de trabalho por TSST). Esta técnica também pode ser um obstáculo para estudos longitudinais com pessoal que trabalha no projeto ao longo do tempo - esses funcionários bem conhecidos não devem ser os que administram o TSST. Além disso, há despesas gerais significativas em termos de manutenção da integridade do TSST ao longo do tempo - especialistas são necessários para rever a fita de vídeoS do TSST, mantenha check-ins semanais com os confederados e forneça sessões periódicas de &quot;atualização&quot; para garantir que não haja deriva na técnica. Além disso, o TSST é difícil de fazer repetidamente para um determinado participante, pois depende de decepções menores e os participantes podem se habituar à técnica. As partes de fala e matemática não são contrabalançadas, o que seria mais otimizado para outras metodologias, como o funcionamento do sistema nervoso autônomo. Não há partes do TSST que não sejam estressantes, por isso requer outra sessão ( ou seja , TSST amigável ou um TSST de placebo) ou qualquer outra coisa ( ou seja , um dia basal) para ter uma comparação sem stress. Finalmente, um estressor não baseado em laboratório pode ser mais eficaz ( ou seja , karaokê, montanhas-russas ou casas assombradas) ou mais ecológicos 41 . Este estudo fornece as bases para futuras pesquisas para utilizar um TSST modificado com jovens vulneráveis. Futuro longitudinalEstudos que buscam reter participantes em várias ondas de coleta de dados também podem precisar modificar sua abordagem utilizando algumas dessas modificações para limitar o desgaste. Além disso, este estudo mostra que é realmente possível criar uma versão modificada do TSST que seja culturalmente sensível enquanto ainda reage a reatividade ao nível apropriado para capturar as diferenças individuais na responsividade do cortisol.

O Teste de Stress Social Trier (TSST) 1 tornou-se o padrão-ouro para induzir o estresse em ambientes de laboratório 2 . É um estressor social bem validado e amplamente utilizado que demonstrou induzir um aumento de 2-4 vezes no cortisol, a produção biológica produzida pelo eixo Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) 1 , 3 . Uma meta-análise concluiu que dois aspectos-chave são fundamentais para induzir a reatividade HPA mais robusta ao longo da vida útil: imprevisibilidade / incontrolabilidade e ameaça social de avaliação (SET), que caracterizam o TSST 3 . A adolescência pode ser um período de tempo chave quando SET é especialmente estressante, marcado por um período sensível de desenvolvimento, pelo qual as interações sociais facilitam a aprendizagem 4 . Por exemplo, durante o início da puberdade e adolescência, a integração com o grupo de pares<html> S torna-se motivantemente saliente 5 . Os aumentos rápidos nos níveis hormonais no início da puberdade influenciam o desenvolvimento de circuitos límbicos, o que leva a aumentos no processamento de estímulos sociais relevantes para o status ( ou seja , admiração) como tendo uma maior relevância motivacional 6 . Esse aumento no envolvimento afetivo social não só influencia influências quanto a motivações e comportamentos no momento, mas também influencia padrões de comportamento e aprendizado motivacional em longos intervalos. Ao longo do tempo, essa mudança na priorização dos incentivos sociais pode levar à exploração da saúde e à tomada de riscos, o que pode promover a aprendizagem e as habilidades sociais e afetivas que sustentam o funcionamento social dos adultos. Assim, não é surpresa que aspectos do funcionamento social envolvidos na fase de fala TSST sejam uma forma potente de estresse para os adolescentes, ou seja , o tópico &quot;bom amigo&quot; 7 , 8 ,No entanto, os indivíduos sensibilizados por uma história de trauma ou eventos de vida estressantes podem ser preparados para reagir mal a situações socialmente avaliativas ou imprevisíveis devido ao controle emocional fraco ou à sensibilidade aumentada ao estresse, e esse padrão de resposta negativa poderia contribuir para Resultados saudáveis ​​negativos, como o uso de drogas ou a busca de emoções perigosas. Assim, a compreensão das respostas biológicas ao SET é de extrema importância para os jovens vulneráveis. Um punhado de estudos explorou como variações de SET e incontrolabilidade influenciam a capacidade de resposta ao estresse. SET pode ser aumentado ou diminuído com base no número de juízes confederados. O TSST pede 2 confederados, mas é mais eficaz com quatro 10 e menos efetivo com 1 - 2 confederados 11 , 12 , 13 ou com um público virtual ou distante 14 , , 16 . Adicionar mais comentários negativos aumenta as taxas de SET e de resposta 11 , 17 , enquanto o comentário positivo reduz as taxas de SET e de resposta 18 . As taxas de responsividade são influenciadas pela mudança da incontrolabilidade de (a) modificar o período de tempo que os participantes têm para preparar o discurso 14 (b) aumentar os recursos psicossociais dos participantes 19 , 20 , 21 ou (c) aumentar a autoconfiança dos participantes antes de O TSST 22 . As modificações que aumentam a supressão de emoção 23 , a vigilância ou a atenção para o estressor 24 , 25 , ou os pensamentos sobre o auto 26 aumentam a capacidade de resposta do TSST. Finalmente, o sexo e a idade de conFederate pode influenciar a reatividade ao estresse para SET 27 , 28 . Estes estudos ilustram que as taxas de responsividade podem ser aumentadas ou diminuídas experimentalmente. No estudo atual, o TSST foi modificado, incluindo solicitações cronometradas, tarefas de matemática alternativas, uso de pares de identidade étnica como confederados, debriefing imediatamente após a conclusão do TSST e usando um examinador de jovens desconhecido para administrar o debrief. Uma revisão recente dos paradigmas do estressor demonstrou efeitos particularmente robustos da ameaça social avaliadora na elevação do cortisol (resposta HPA) durante a adolescência média 29 . No entanto, existem preocupações válidas sobre o uso do TSST com jovens vulneráveis. Especificamente, as preocupações com a proteção dos indivíduos humanos podem ser levantadas para garantir que os benefícios superam os riscos, pois existe o potencial trauma associado à persistência do TSST quando os jovens já estão vulneráveis ​​( por exemplo, </Em&gt;, provenientes de ambientes de pobreza e adversidades de início da vida). Assim, há a necessidade de garantir que os jovens não se afastem em estado de elevação de ansiedade ou agitação. No entanto, as modificações na TSST para aliviar / atenuar algumas dessas preocupações não devem reduzir a eficácia geral ou a validade do estressor. Por exemplo, estudos prévios documentaram os efeitos de versões modificadas do TSST para jovens vulneráveis, mas tiveram sucesso limitado em termos de provocar um aumento no cortisol 30 , 31 . Além disso, podem ser necessárias modificações para tornar o TSST mais culturalmente sensível e apropriado. Por exemplo, há literatura que sugere interagir com indivíduos de raças diferentes podem induzir estresse e reações de ameaça 32 . Diferenciando a composição racial do participante e o comitê do TSST foi mostrado para não impactar a reatividade do cortisol ao TSST 33 , mas sim impAto de recuperação do cortisol da TSST 34 . Assim, o uso de confederados de mesma raça / etnia para o TSST pode eliminar qualquer confusão desnecessária da raça dos confederados sobre a ameaça de estereótipo percebida e a recuperação do cortisol da TSST. O presente estudo ocorreu no contexto de um estudo longitudinal de coorte de nascimentos de famílias mexicano-americanas na Califórnia chamado Centro de Avaliação de Saúde de Mães e Crianças de Salinas (CHAMACOS). Esta amostra é caracterizada como altamente vulnerável devido a altas taxas de pobreza (76% das famílias estavam em ou abaixo do nível de Pobreza Federal) e um elevado número de eventos adversos da vida adiantada (número médio de eventos de vida = 4,5 para a amostra, SD = 3.3). Em comparação, um grande estudo retrospectivo realizado por uma parceria entre os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos e Kaiser Permanente, com base em milhares ou entrevistados, encontrou apenas 13% relataram 4 ou mais chi adversosEventos temporários 35 . O TSST foi administrado aos jovens neste estudo como parte de uma grande bolsa NIH destinada a pesquisar a ligação entre eventos adversos da vida adiantada, reatividade biológica à ameaça social avaliativa aos 14 anos (quando o TSST foi administrado) e comportamentos de risco (Aos 16 anos de idade, a coleta de dados ainda está em andamento, grant1R01DA035300). Durante os estágios iniciais da pilotagem do TSST, observamos que a abordagem precisava ser deslocada para se tornar contextualmente sensível às necessidades exclusivas dessa população e mitigar as respostas precárias ( ou seja , chorar, ficar bravo, se desviar da TSST). Para ser preciso, tivemos uma taxa de 20% de respostas comportamentais precárias ao TSST antes de modificações ( ou seja , 4 dos 20 participantes de TSST ou gritaram ou responderam com raiva), enquanto que apenas 5% responderam com respostas precárias após a implementação das modificações. O pessoal de estudo também ficou atento à importância da retaIniciando jovens neste estudo longitudinal. Deve-se notar que, durante a fase piloto, os indivíduos que responderam ao TSST com reações de estresse extremas comportamentais durante o debrief foram, no nível biológico, &quot;não respondedores&quot;, ou seja , não demonstraram aumento do cortisol. Essa justaposição emocional / biológica a partir desses resultados iniciais também evidenciou a necessidade de modificar o TSST para criar as condições ideais para induzir uma resposta biológica apropriada ao TSST. Assim, este estudo fornece evidências preliminares a partir de uma sub-amostra de jovens da eficácia do TSST modificado para induzir a reatividade do cortisol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">TSST</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 white lab coats</td>
			<td>Dickies</td>
			<td>83403</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 clip boards</td>
			<td>Staples</td>
			<td>21423</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 pens</td>
			<td>BIC</td>
			<td>GSM609-Blk</td>
			<td>For confederates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>B00EYU3E7I</td>
			<td>For confederates to sit behind</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video Camera &#38; Tripod</td>
			<td>Sony</td>
			<td>K-86674-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paper&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>For participant&#39;s preparation period</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saliva samples</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latex gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19041171C</td>
			<td>To collect saliva samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 mL cryovials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W985872-100</td>
			<td>4 per participant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80 C freezer</td>
			<td>So-Low</td>
			<td>U85-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#39;&#39; straws&#160;</td>
			<td>Genuine Joe</td>
			<td>GJO58925</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified trier social stress test for vulnerable mexican american adolescents

O Teste de Stress Social de Trier (TSST) é um estressor social bem valido e amplamente utilizado que mostrou induzir um aumento de 2-4 vezes no cortisol, a produção biológica produzida pelo eixo hipotálamo-hipofisário-adrenal (HPA) em seres humanos. Enquanto estudos exploraram como as modificações no TSST influenciam a capacidade de resposta ao estresse, poucos estudos criaram um TSST modificado apropriado para jovens vulneráveis ​​que provoca uma resposta significativa ao estresse do cortisol. Assim, o presente estudo procurou modificar ou ajustar o TSST de forma culturalmente sensível para uma amostra vulnerável de adolescentes de 14 anos. O presente estudo ocorreu no contexto de um estudo longitudinal de coorte de nascimentos de famílias mexicano-americanas na Califórnia chamado Centro de Avaliação de Saúde de Mães e Crianças de Salinas (CHAMACOS). A amostra de CHAMACOS foi ideal para testar a eficácia de uma TSST culturalmente adaptada, pois é composta por jovens mexicano-americanos, que são deDez excluídos da pesquisa. Esses jovens também experimentaram adversidades significativas na vida adiantada. As modificações de exemplo incluíram avisos cronometrados, tarefas de matemática alternativas, uso de pares de identidade étnica como confederados, debriefing imediatamente após a conclusão do TSST e usando um examinador de jovens desconhecido para administrar o debrief. As amostras de saliva foram coletadas na linha de base (após uma fase de repouso), e depois novamente aos 15, 30 e 45 minutos após o início do TSST para avaliar a concentração de cortisol. Um estudo piloto de 50 participantes (50% feminino) foi analisado quanto à reação de cortisol à TSST. Os resultados confirmaram que esta versão modificada do TSST foi bem sucedida ao provocar uma reação significativa de cortisol, com uma ampla variabilidade provável devido a diferenças individuais. Os objetivos para modificações e considerações étnicas são discutidos. Este estudo fornece as bases para futuras pesquisas para utilizar um TSST modificado com jovens vulneráveis.

A amostra consistiu em crianças de 14 anos que fizeram parte de um estudo de coorte bem caracterizado, estabelecido, o Centro de Avaliação de Saúde de Mães e Crianças de Salinas (CHAMACOS). Este estudo consiste na primeira coorte de 325 famílias mexicano-americanas que vivem em uma comunidade de trabalhadores agrícolas na Califórnia e seguiram prospectivamente desde que estavam no útero. O TSST não foi administrado à segunda coorte CHAMACOS de 300 crianças seguidas desde os 9 anos de idade. Os adolescentes foram selecionados para participar da TSST se o QI da escala completa fosse &lt;70 de uma visita prévia (12 anos), se o adolescente fosse diagnosticado com autismo por relatório materno, se os comportamentos atípicos extremos mostrados na clínica em visitas passadas ( ou seja, pronunciado Desconfiança / paranóia sobre o estudo, ver coisas ou pessoas que não estão lá - por relatório materno), se seu índice de detecção de depressão fosse ≥3 SD acima da média para idade e sexo e se tEle adolescente relatou envolvimento em uma luta de gangues no ano anterior. Esses critérios de exclusão foram adicionados com base na sobre-resposta inicialmente ao TSST, mas não está claro se esses critérios de exclusão fizeram diferença nos resultados finais. Além desses critérios de exclusão, os participantes foram matriculados independentemente da sua saúde física e psicológica. No final, 264 adolescentes completaram o TSST na íntegra, sem problemas reportados ou sem problemas até o esclarecimento. A Tabela 1 lista o número de participantes que foram excluídos e por que eles foram excluídos. Não houve diferenças demográficas entre aqueles que completaram versus não completaram a TSST. As amostras de saliva foram armazenadas a -80 ° C até serem enviadas em gelo seco para colegas da Universidade Estadual de Iowa ( ou seja , laboratório de nível de biossegurança II). Após a chegada, amostras de saliva congeladas foram catalogadas e colocadas novamente em um congelador de -80 ° C. EmO dia do ensaio, cada amostra de saliva foi descongelada e ensaiada dentro de 24 h, em duplicado, usando kits de imunoensaio enzimático altamente sensíveis e bem-estabelecidos. Os coeficientes de variação intra-ensaio médios (CVs) foram inferiores a 2,25% e o CV inter-ensaio médio foi de 5,13% para o cortisol. A amostra foi reanalisada se o CV para as medidas duplicadas fosse superior a 7%. As estatísticas descritivas para as medidas de cortisol, juntamente com desvios padrão em cada amostra, são fornecidas na Tabela 2 e descritas na Figura 1 . Foram avaliadas 2 x 4 medidas repetidas ANOVA para testar os efeitos do sexo nas quatro amostras de saliva. Houve um efeito principal para a resposta do cortisol ao TSST ( F = 9.09, p &lt;0.001), mas o sexo não foi um preditor significativo da resposta do cortisol ao estresse ( F = 1.03, p = .39). O índice médio de massa corporal foi de 23,53, e também não foi um preditor significativo da repetiçãoTed mede corozol ANOVA ( F = 1,03, p = 0, 38). Como seria de esperar, os testes t de amostras pareadas (fornecidos na Tabela 3 ) revelaram alterações significativas no cortisol do pré-estresse até o início pós-estressor de 15 min, desde o início pós-estressor de 15 min até o início pós-estressor de 30 min e de 30 minutos pós-estressor para 45 min pós-estressor. A maior alteração no cortisol ocorreu ao comparar a concentração de cortisol pré-estresse com a concentração pós-estressor de 30 min, consistente com pesquisa prévia ( D = 0,80 de Cohen) 1 , 3 . Indivíduos que foram marcados como tendo um tempo difícil com o TSST tendem a relatar reações de estresse aumentadas ao estressor, mas relataram voltar a um estado normal antes do final do estudo. Enquanto a concentração pós-estressor de 30 min foi a maior concentração dessas amostras, a concentração de cortisol pós-estressor de 45 minutos sugere que os indivíduos começaramPara se recuperar do estressor, uma vez que a concentração pós-estressor de 45 min foi significativamente inferior à concentração de 30 min (ver Tabela 3 ). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393fig1.jpg" /> Figura 1: Reatividade de Cortisol para a TSST. Os meios de reatividade do cortisol são traçados com desvios padrão. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55393/55393fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/55393/55393table1.jpg" /> Tabela 1: Razões para a exclusão. Os participantes foram excluídos do estudo se eles começaram o TSST, mas pararam antecipadamente, recusaram-se a participar, foram excluídos do projeto ou foram ignorados devido a problemas relacionados ao projeto. Tabela 2: Concentrações médias de cortisol e desvios-padrão. O cortisol aumentou das amostras 1-3 e depois declinou pela amostra 4. <img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/55393/55393table3.jpg" /> Tabela 3: testes t de amostras emparelhadas. Compara amostras entre si na concentração de cortisol (μg / dL) e desvios padrão (DP) para alteração do cortisol. Aumentos significativos no cortisol foram observados a partir da amostra de base para amostras pós-estresse.

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A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

Aqui, apresentamos um protocolo que provocou reatividade do cortisol em uma amostra adolescente adolescente mexicana vulnerável utilizando uma versão modificada do Teste de Stress Social Trier (TSST). As amostras de saliva foram coletadas no início, 15, 30 e 45 min após o início do TSST. Pesquisas futuras poderiam utilizar este TSST modificado com jovens vulneráveis.

Um Teste de Stress Social Modificado de Trier para Vulneráveis ​​Mexicano-Adolescentes

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

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Developmental Biology

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Stress and Lifestyle

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12.7K visualizações.  University of California, Berkeley.  Aqui, apresentamos um protocolo que provocou reatividade do cortisol em uma amostra adolescente adolescente mexicana vulnerável utilizando uma versão modificada do Teste de Stress Social Trier (TSST). As amostras de saliva foram coletadas no início, 15, 30 e 45 min após o início do TSST. Pesquisas futuras poderiam utilizar este TSST modificado com jovens vulneráveis. 

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Biologia do Desenvolvimento

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Um Teste de Stress Social Modificado de Trier para Vulneráveis ​​Mexicano-Adolescentes

Um Teste de Stress Social Modificado de Trier para Vulneráveis Mexicano-Adolescentes