Name: long-term live imaging of drosophila eye disc
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Wir sind dankbar, dass Chun-lan Hsu und Yu-Chi Yang die Fliege Nahrung für die Vorbereitung und Pflege der Fliegen Aktien und zu Su-Ping Lee und das IMB-Imaging-Core für ihre Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, unterstützt MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) von der National Science Council und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Republik China.

1. Pre-Versuchsaufbau <ol><li> Sammeln Sie eine Fliege Ei, das Kern grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter mδ0.5-Gal4 und Kultur bei 25 ° C für 5 Tage zum Ausdruck bringt. </li><li> Mikrowellen 0,7 g niedrig schmelzende Agarose in 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bis die Agarose vollständig gelöst ist. Halten Sie das 0,7% niedrigschmelzendes Gel in einem 37 ° C Inkubator bis zur Verwendung. </li><li> Sterilisiert alle Geräte, einschließlich Zangen, Scheren, 42 mm x 0,17 mm Deckgläser, eine 9-well Glases Tüpfelplatte und eine magnetische Kulturkammer, mit 70% Ethanol für mehr als 12 h. </li><li> Bereiten Sie die Kulturmedium 3: Schneiders Drosophila - Medium , ergänzt mit 2% fötalem Rinderserum (FBS), 0,5% Penicillin-Streptomycin und 1,25 mg / ml Insulin. Zur Vermeidung von Kontaminationen, bereiten Sie das Medium in einer Zellkultur Kapuze. Lagern Sie die zubereitete Kulturmedium bei 4 ° C und innerhalb eines Monats verwendet. </li><li> Reinigen Sie die Dissektion Plattform und den Experimentator‘Hände mit 70% Ethanol vor der Präparation beginnen. </li></ol> 2. Disc Dissection <ol><li> Luft trocknet die gesamte Ausrüstung aus 70% Ethanol. </li><li> Wählen Sie eine im dritten Häutungsstadium Larve aus einer Fliege Fläschchen. Um eine Kontamination durch das Fliegen Fläschchen zu vermeiden, waschen Sie die Larve in 1x PBS 3x um den Abfall zu entfernen. </li><li> Seziert die gereinigte Larve in 1 ml Kulturmedium (bei RT) in dem 9-well Glas Tüpfelplatte unter einem Dissektionsmikroskop. </li><li> Fassen die Larve mit einer Pinzette auf etwa ein Drittel des Weges von dem hinteren Ende und eine weitere Zange an der Mündung Haken. Ziehen Sie die beiden Zangen in entgegengesetzten Richtungen um die inneren Gewebe freizugeben. <ol><li> Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Fettkörper und Nagelhaut aus dem Auge-Hirn-Komplex an den Mund Haken befestigt. Wenn die Bauchmark noch angebracht ist, schneiden sie mit einer Schere entfernt. </li></ol></li><li> Verwenden einer Pinzette das Mund Haken und ein Paar von Zangen zu greifen ein Stück Gewebe zu entfernen, die connects das Gehirn und Augenscheiben im Rückenteil. HINWEIS: Wenn dieses Gewebe nicht entfernt wird, die beiden Augen antennal Scheiben werden miteinander und das Gehirn nahe sein. Die Augenscheiben werden dann nicht flach liegen auf dem Deckglas, da dieses Gewebe, das Gehirn und das Auge-antennal Disc wird ein Dreieck bilden. </li><li> Drehen Sie den gesamten Komplex zu einer ventralen-Position nach oben. Entfernen Sie den Faden, der den Haken oder Scheibe an das Gehirn verbindet. HINWEIS: Wenn der Faden nicht entfernt wird, die Auge-antennal Disc wird in zwei Stück aufgeteilt, wenn der Mund Haken entfernt wird. <ol><li> Entfernen Sie den Mund Haken. Achten Sie darauf, nicht das Auge Scheibe während des Prozesses nicht zu beschädigen. HINWEIS: Die Augenscheibe ist nun frei im Medium und nur durch den optischen Stiel Gehirn verbunden. </li></ol></li></ol> 3. Montage <ol><li> Luft trocknet und die Bestandteile der Kammer mit einem 42 mm x 0,17 mm Deckglas montieren. Befestigen einer Doppelschicht von O-Ringen an der Mitte des Deckglases zu halten the Agarose. </li><li> Bauen Sie die Kammer mit Deckglas. Setzen Sie die 42 mm x 0,17 mm Deckglas auf der Bühne Akzeptor. Platzieren Sie den Silizium O-Ring auf dem Deckglas. Legen Sie die Basis. Sperren die Dichtungs Schließfach und den Deckel (Abbildung 1). </li><li> Sorgfältig seziert übertragen die Auge-Gehirn-Komplex an das Zentrum des O-Rings mit einem 10-200 &amp; mgr; l einer 20 uL tip Mikropipette verwenden. </li><li> Entfernen der größte Teil des Mediums und fügen 12 ul von 0,7% niedrigschmelzende Agarose (bei 37 ° C) der Probe. HINWEIS: Die Position des Auges Scheibe kann mit einer Pinzette vor der Verfestigung der Agarose geändert werden. Die Agarose wird innerhalb von 5 min verfestigen. <ol><li> 1 ml Kulturmedium bei Raumtemperatur in der Mitte des O-Rings; jeder O-Ring kann bis zu 4 Proben laden. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf den O-Ring aufgeklebt wird, um das Driften der Probe zu vermeiden. HINWEIS: Keine Belüftung oder Zirkulation des Mediums erforderlich ist. </li></ol></li></ol>4. konfokale Mikroskopie <ol><li> Platzieren Sie die Kammer auf der Stufe eines invertierten Konfokalmikroskop für 30 min, die Temperatur äquilibrieren. Dies kann Z-Achsen-Drift während des Abbildungs ​​verhindern. </li><li> Vor dem Langzeit-Echtzeit-Bildgebung, überprüfen, ob das Gewebe durch Differentialinterferenzkontrastmikroskopie intakt ist. </li><li> Um die Phototoxizität zu vermeiden, verwendet eine Laserleistung von weniger als 2 mW. Verwenden, um ein 40X-Objektiv für die Bildgebung. </li><li> Acquire 62 um Z-Stapel Bilder in 12 min bei einem optischem Abstand von 1 &amp; mgr; m. Acquire 40 Zyklen von Scans über insgesamt 10 h. Stellen Sie sicher, dass jeder Zyklus 12 min von Abbildungs ​​enthält und 3 min ruhen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für ein langfristiges Live - Imaging - Experiment auf Drosophila Imaginalscheibe. Wir haben viel Zeit, um die sorgfältige Präparation Üben Scheibenschäden zu vermeiden und für die Befestigung der Scheibe nahe der Deckgläser zu ermöglichen. Wir haben versucht, Poly-L-lysin (PLL) und niedrigschmelzender Agarose in das Gewebe zu halten; Am Ende zeigte die niedrigschmelzende Agarose eine bessere Fähigkeit, das Gewebe zu halten. Obwohl nur das Auge Scheibe in diesem Papier verwendet wurde, das normale Auftreten von Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation während der 10 h Live-Abbildungsperiode zu zeigen, kann dieses Verfahren auch auf mindestens eine anderen Scheibe aufgebracht werden, wobei die Flügelscheibe, wie in einem demonstrierte frühere Studie 3. Darüber hinaus ist das Kulturmedium Vorbereitung und Live-Imaging-Setup einfach und nicht Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich. Kontinuierliche Echtzeit-Bildgebung kann eine klare zeitliche Abfolge von biologischem Vorabend bereitzustellennts. In unserem früheren Bericht von Glia - Differenzierung und Migration in die Augen Scheibe, wenn wir direkten Beweis dafür , dass Einwickeln Glia aus bestehenden Glia differenzieren nach an der Vorderseite des Auges Scheibe 3 migrieren. Langfristige ex vivo Kultur ermöglicht die gezielte Laser-aktivierte Markierung von Zellen, wie die Foto-Umwandlung des KAEDE fluoreszierenden Proteins, um ihr Verhalten 3 zu folgen. Es kann auch die Prüfung von Chemikalien aufnehmen, die direkt dem Kulturmedium zugegeben werden; Somit kann es als Wirkstoff-Screening-Plattform verwendet werden. Da einige dynamischer Prozess innerhalb von Minuten oder Sekunden auftreten, ist eine hohe zeitliche Auflösung erforderlich. Zur Verbesserung der zeitlichen Auflösung, Lichtblattmikroskopie 15, 16 oder Rotationsscheibenmikroskopie 17 kann eine gute Option sein. Die aktuelle Kulturbedingung ist nicht perfekt. Dabei spielt es keine Scheibe Wachstum unterstützen. Zelle pRolltation wird nur bis zu 12 h unterstützt 3 . Nach 12 h in ex vivo- Kultur beginnt die Rate der Photorezeptor-Differenzierung 3 zu sinken. Dies kann auf den Mangel an bestimmten Nährstoffen oder Hormonen zurückzuführen sein. Da der Hauptunterschied in diesem Kulturmedium die hohe Konzentration an Insulin ist, kann das Säugetierinsulin teilweise die Funktion endogener Insulin-ähnlicher Peptide nachahmen. Die Zugabe von Fliegextrakt, der Insektenblutzucker Trehalose und verschiedene Konzentrationen des hämmernden Hormons 20-Hydroxyecdyson waren nicht vorteilhaft 3 . Allerdings reicht die 12-18 h Kulturperiode aus, um viele Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Alternative Kultivierungsmethoden für die Kultivierung von Larven-Imperialscheiben wurden verglichen 3 , und unsere Kultivierungs- und Imaging-Bedingung liefert das längste Zeitfenster und die meisten Klarheit für die Live-Bildgebung. Obwohl Scheiben in lebenden Larven und Puppen direkt abgebildet werden können18, 19, 20, 21, 22, die Auflösung und die Zeitfenster für die Beobachtungen sind begrenzt. Am späten Larven- und Puppen - Discs können für eine lange Zeit 23, 24, kultiviert werden , aber die Scheiben durchlaufen erhebliche Morphogenese. Um die Vorteile der flachen 2D Larvenscheiben zu nehmen, unsere Kultivierung und Abbildungsverfahren ist die beste Lösung so weit.

Das Drosophila Larven Imaginalscheibe hat ein beliebtes Experimentiersystem für die Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Mechanismen gewesen. Diese Scheiben invaginieren aus dem embryonalen Epithel und werden sackartige Strukturen , die durch zwei Epithelschichten, Peripodial Epithelium (PE) und Disc Proper (DP) 1, 2 aufgebaut. Die Imaginalscheibe Zellen vermehren und schrittweise während der Larven- und Puppenstadien unterscheiden und schließlich in die adulten Körperstrukturen zu entwickeln. Durch die flache und einfache Zweischichtstruktur der Imaginalscheibe, sind sie leicht, wenn sie von Larven seziert zu beobachten. Doch trotz einiger Bemühungen von vielen Gruppen, die aktuellen Methoden für die langfristige Kultur der Imaginalscheibe sind nicht zufriedenstellend. Vor kurzem haben wir eine Kultur Methode entwickelt , die die normale Entwicklung von mehreren Imaginalscheibe für bis zu 18 Stunden aufrecht erhalten können und das erlaubt die Live - Darstellung 3 </sup&gt;. Die Kulturverfahren können die Zelldifferenzierung und Migration unterstützen, aber es kann die Zellproliferation für nur 12.07 h unterstützt und kann nicht Disc Wachstum unterstützen. Der Hauptunterschied in dem Kulturmedium ist die hohe Konzentration von Insulin 3. Das Verfahren ist einfach, und keine spezielle Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich ist. Eines der besten erforschten Imaginalscheibe ist der Blick antennal Scheibe. Das Drosophila Auge besteht aus etwa 800 Ommatidien aufgebaut. Jedes Ommatidium besteht aus acht Sehzellen (R1-R8). Im Larvenaugenscheibe unterscheiden die Sehzellen nach dem Durchgang der Morphogenetic Furche (MF), die über das Auge Scheibe von posterior nach anterior streicht 4, 5. Die Photorezeptoren in einer Ommatidium in Sequenz unterscheiden, mit R8 beginnen, gefolgt von R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 und R7 6. Die Ommatidien in den dorsalen und ventral Hälften der Auge Scheibe durchlaufen eine Drehung um 90 ° in entgegengesetzten Richtungen, was zu einer entgegengesetzten Chiralität 7, 8. Der Rotationsvorgang erfolgt in zwei Stufen: Zunächst wird eine 45 ° Drehung beginnt an und wird bei der sechsten Ommatidien Reihe hinter der MF beendet; die zweite 45 ° -Drehung wird bei etwa 16 Zeilen abgeschlossen 9, 10. Diese Studie Ommatidienrotation verwendet, gekennzeichnet durch die R3 / 4-spezifischen mδ0.5 Ga4-11, die normale Zelldifferenzierung und Dynamik zu demonstrieren , die durch diese Methode zur Kultur und Live-Bild , um das Auge Scheibe beobachtet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Live-Bildgebung bietet die Möglichkeit, kontinuierlich dynamische zelluläre und Entwicklungsprozesse in Echtzeit zu verfolgen. Drosophila Larven Imaginalscheibe verwendet wurden viele biologische Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Wachstum, Migration, Apoptose, Wettbewerb, Zell-Zell - Signalübertragung und compartmental Grenzbildung zu untersuchen. Allerdings Methoden für die langfristige ex vivo Kultur und die Bildgebung der Imaginalscheibe waren nicht zufriedenstellend, trotz vieler Anstrengungen. Vor kurzem haben wir ein Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung von Imaginalscheibe für bis zu 18 h. Neben eine hohe Insulinkonzentration in dem Kulturmedium zu verwenden, ein niedrigschmelzendes Agarose wurde auch einzubetten die Scheibe zu verhindern, dass es ein Abgleiten während des Abbildungsperiode verwendet. Dieser Bericht verwendet die Augen antennal Scheiben als Beispiel. Photorezeptor R3 / 4-spezifische mδ0.5 Ga4-Expression wurde gefolgt, dass der Photorezeptor differen zu demonstrierenzierung und Ommatidienrotation können während einer 10 h Live-Abbildungsperiode beobachtet werden. Dies ist ein detailliertes Protokoll diese einfache Methode beschreibt.

<html> In diesem Beispiel wurden die R3 / R4 Photorezeptoren mit mδ0.5 Ga4-markierter Photorezeptordifferenzierung zu überwachen. mδ0.5-Ga4 treibt starke Expression in R4 und schwächere Expression in 11 R3, es einen ausgezeichneten Marker für R3 und R4 zu machen, als auch für den Prozess der Ommatidienrotation. In Film 1 wurden R3 und R4 mit GFP markiert. Zu Beginn der 10 - h-Live - Imaging - Sitzung gab es 8 Reihen von Ommatidien Cluster (2A und Film - 1) und 14 Reihen von Ommatidien Clustern am Ende (2B). Die Rate der Ommatidien Differenzierung betrug 1,67 h pro Reihe, die in vivo in Scheiben 7, 8, 9, 10, 11 auf die Rate von 1,5-2 h / Zeile liegen,s = &quot;Xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Auf der Grundlage der relativen Positionen von R3 und R4, aufgetreten Ommatidienrotation in der ex vivo kultiviert Scheibe während der Live - imaging (2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39; und B &#39;&#39;). Ein einzelner R3 / R4 Clusters wurde mit einem weißen Bereich in dem ersten Frame von Video 2 bezeichnet. Am Anfang wird die R3 / R4 Achse zum Äquator (2C und Film 2) zu sein , die senkrecht. Es scheint , dann 15 °, 30 ° zu drehen, und 45 ° in 3 (2C &#39;), 6 (2C &#39;&#39;) und 9 (2C &#39;&#39;&#39;) h, respectively. Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Methode Photorezeptordifferenzierung während der 10 h aufrecht erhalten kann Echtzeit-Bildgebung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Schematische Darstellung der Kammerversammlung. Schematische Darstellung der Kammeranordnung: (1) Setzen Sie das zweischichtigen O-Ring-Attached - Deckglas auf der Bühne Akzeptor. (2) Den Silizium O-Ring auf dem Deckglas. (3) Die Base. (4) Sperren des Dichtungs Schließfach. (5) Laden der Probe in die Mitte des O-Ring und die Abdeckung platzieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Abbildung 2: Live - Imaging von R3 / R4 Differenzierung und Rotation. Kernform-GFP während 10 h von Echtzeit-Bildgebung R3 / R4 mit mδ0.5 Gal4-markiertem ausdrückt. Alle Figuren wurden von dem Film 1 eingefangen. (A) Bild am Anfang genommen. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A“) Bild aus dem eingerahmten Bereich auf der linken Seite (A‘) und rechts (A vergrößerte“). (B) Bild am Ende des 10 h - Zeitraums entnommen. (B&#39;-B“) Bild von dem eingerahmten Bereich vergrößert auf der linken Seite (B‘) und rechten (B“). (CC ‚‘ ‚) mit einem einzigen R3 / R4 Paar (gekennzeichnet durch einen Pfeil in A‘) wird durch die Zeit verfolgt , die Drehung des R3 / R4 Paares zu zeigen. Maßstabsbalken = 15 &amp; mgr; m, 10 &amp; mgr; m und 5 &amp; mgr; m in A, B und C ist. Alle Figuren sind maximale Intensität z-Projektionen. min: Die Zeitskala ist in h gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi“target =‚_ blank‘&gt; Bitte hier klicken, um diesen Film herunterzuladen. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">diesen Film herunterzuladen.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Aufrufe.  National Yang-Ming University.  Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich. 

Serie: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologie

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erweiterte Live-Bildgebung der Morphogenese der Puppenbein von Drosophila ohne Puparium

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Aufdeckung dynamischer Epithelstrukturen während der Entwicklung von Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Langfristige Live-Imaging von

Zusammenfassung

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Live-Bilder aus dem

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene

Langfristige Live-Imaging von

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A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila

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Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in