Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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Los autores agradecen al Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por las discusiones sobre el protocolo original para la generación y mantenimiento de animales libres de nervios, la Sra. Rui Wang para ayudar con la adaptación de la jeringa y la aguja técnica, y Danielle Hagstrom y Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el RCSA y la subvención NSF CMMI-1463572.

1. Tratamiento doble de la colchicina <ol><li> Hacer una solución de colchicina (peso / volumen) al 0,4% en medio 3 , 4 , 17 de Hydra . Precaución: La colchicina es extremadamente tóxica, fatal si se ingiere, puede causar defectos genéticos y puede causar daño ocular. Manipule el polvo en una campana extractora y lleve equipo protector personal completo (PPE). </li><li> Incubación Se utilizó Hydra vulgaris (cepa AEP) que se ha dado hambre durante 24 h en colchicina al 0,4% a razón de 5 Hydra por ml de solución de colchicina en una placa de Petri durante 8 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: 5 La colchicina Hydra / mL es una guía para determinar cuánta solución utilizar para evitar el hacinamiento del plato con Hydra . Utilice el mismo volumen de solución para limpiezas posteriores y cambios en la solución. </li><li> Retire la solución de colchicina yCon medio limpio de Hydra sin colchicina. Lavar la Hydra 5 veces por transferencia en serie con una pipeta Pasteur de vidrio en medio limpio de Hydra antes de transferir a 50 μg / mL de rifampicina en medio Hydra . Mantenga la Hidra en una incubadora a 18 ° C. Nota: Se puede almacenar suficiente cantidad de rifampicina en dosis de 1.000X (50 mg / ml) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) durante 1-2 semanas de tratamiento a 4 ° C. La cantidad exacta puede determinarse por el volumen total de solución utilizado cada día. Por ejemplo, si hay 2 platos, cada uno con 10 mL de solución que se necesita cambiar dos veces al día, se utilizará un total de 40 mL de solución en un día, lo que corresponde a 40 μl de 1,000X de stock por día o 560 μL Durante un período de dos semanas. El stock se diluye después 1: 1000 en medio Hydra al usarlo. Precaución: DMSO es un líquido combustible y penetra fácilmente en la piel, permitiendo que otros químicos disueltos en el cuerpo. ManoEl solvente en una campana de humos y el desgaste PPE completo. De notar, el DMSO se congela a 4 ° C </li><li> Cambiar el medio de Hydra que contiene rifampicina dos veces al día hasta que el Hydra deje de expulsar las células al medio, lo que generalmente es una semana después del tratamiento. En este punto, el medio se puede cambiar una vez al día. Durante los días siguientes al tratamiento, la Hidra perderá completamente sus tentáculos. Evite tener la Hydra en contacto entre sí, ya que pueden fusionarse y dar lugar a Hydra extraño en forma ( Figura 2 A ). <ol><li> Para evitar el contacto, evite girar el plato en un movimiento circular. En su lugar, agite suavemente el plato en dirección vertical y horizontal hasta que la Hydra se separe. Inspeccione el plato cuando coloque la Hydra en la incubadora a 18 ° C y ajústela según sea necesario. Nota: Para los días en que el medio se cambia dos veces, cambie el medioUna vez por la mañana y otra vez por la tarde / noche. </li></ol></li><li> Una vez que los tentáculos comienzan a formarse, comience la alimentación forzada y eructar la Hydra 3 a 4 veces por semana (vea Secciones 2 y 3). Aproximadamente 8-9 días después del tratamiento con colchicina, la Hidra comenzará a hacer crecer sus tentáculos. Nota: El rebrote del tentáculo varía entre los individuos. Algunos pueden tomar más de 8 a 9 días antes de mostrar señales de crecimiento de tentáculos. Aquellos que no vuelvan a crecer sus tentáculos, así como animales de forma extraña ( Figura 2 B ) o animales demasiado pequeños para ser alimentados deben ser eliminados. Es probable que estos Hydra no sobrevivan al segundo tratamiento. La Hydra también puede brotar. Sin embargo, algunos de los brotes todavía pueden tener células intersticiales y ser capaces de comer por su cuenta. <ol><li> Quite los brotes que pueden comer sin ayuda y separar del animal de padre. Identifique estos animales añadiendo Artemia viva a laAlimentando el plato y observando si o no los animales cogen y comen el Artemia en sus los propios. 1 o 2 Hydra también puede ser capaz de comer por su cuenta. También deben descartarse. Nota: La hidra libre de nervios tiene una morfología similar a un globo, y tentáculos que son más cortos y más finos de lo normal (debido a la pérdida de nematocitos) y pueden distinguirse fácilmente de los animales de aspecto normal ( Figura 1A, 1B ). </li></ol></li><li> Tres semanas después del primer tratamiento con colchicina, repita el tratamiento con colchicina (pasos 1.1 - 1.5). Un segundo tratamiento de colchicina es necesario para eliminar el resto de las células intersticiales y las células nerviosas [ 3] . </li></ol> 2. Alimentación forzada <ol><li> Añadir quistes de Artemia a un recipiente de vidrio estrecho y alto que se estrecha en la parte inferior. Llenar el recipiente con agua Artemia (NaCl 6,72 M). Evita exceEding 1 g de quistes por 1 L de agua para un mayor rendimiento de escotilla. <ol><li> Cubrir la parte superior del recipiente con parafilm e insertar una pipeta serológica de 10 ml a través del parafilm en el recipiente. Proporcione la aireación uniendo el tubo a una bomba de aire del acuario y ajustando el tubo alrededor de la pipeta. Asegúrese de que la punta de la pipeta llegue a la parte inferior del recipiente y que no quistes se establecen en la parte inferior. La Artemia eclosionará después de 48 h. Nota: Hay muchas maneras diferentes de tramar Artemia que pueden funcionar igual de bien. </li></ol></li><li> Colar la Artemia del agua de Artemia en una red de Artemia (disponible en las compañías de suministro de acuario) y lavarlos durante unos 20 s en agua DI antes de colocarlos en un plato con medio Hydra . La salinidad del agua de Artemia es demasiado alta para Hydra , por lo que la Artemia debe ser lavada antes de ser utilizada. </li><li> Bajo un microscopio de disección,Eutanasiar la Artemia apretándolos ligeramente con un par de pinzas finas. Evite apretar lo suficientemente duro para expulsar las tripas, ya que se adhieren a la pinza y hacer la alimentación difícil. Apretar ligeramente la Artemia antes de alimentarla a la Hidra ayudará con el proceso de digestión 14 . Coloque la recién muerta Artemia cerca de la Hydra en el plato para facilitar la alimentación rápida. Nota: Todos los pasos posteriores se realizan bajo un microscopio de disección. </li><li> Utilice un par de fórceps para sostener la hidra por el pedúnculo. Continúe sosteniendo el pedúnculo durante el proceso de alimentación de la Hidra . Usando un segundo par de pinzas, pellizque la columna del cuerpo para hacer que el Hydra se contraiga. </li><li> Mientras sostiene las puntas del segundo par de pinzas juntas, toque en el centro del hypostome (la estructura abovedada en el extremo oral del animal). Esto a veces hace que la boca se abra. yoF la boca no se abre golpeando, perforar la boca insertando el fórceps en el centro del hipostótomo y luego liberar ligeramente la presión sobre las puntas del fórceps. Esto debe estirar la abertura de la boca hecha por la punción. Nota: La hidra puede desinflarse y colapsarse cuando se abre la boca ( Figura 2 C ). Si esto ocurre, la Artemia puede todavía ser insertada en la Hidra . Si es demasiado difícil hacerlo, pasar a la siguiente Hydra y volver a la Hydra original algún tiempo más tarde e intentarlo de nuevo. La Hidra tiende a no desinflarse tanto durante las aberturas posteriores de la boca. </li><li> Recoger rápidamente Artemia con la pinza e insertarlas en la cavidad gástrica de la Hidra . Insertar tantas Artemia como sea posible hasta que la cavidad gástrica esté llena y no pueda insertarse más Artemia sin dañar la Hidra , accidenteTirando hacia fuera cualquier Artemia adentro, o evitando que la boca se cierre. En promedio, esto es 5-6 Artemia , sin embargo hasta 12 han sido alimentados a los animales más grandes. <ol><li> Si la boca comienza a cerrarse, estirar de nuevo con la pinza como se describe arriba; Sin embargo, se debe tomar precaución como cualquier Artemia ya dentro del animal puede comenzar a salir cuando se reabre la boca. </li><li> Si la Hydra es demasiado pequeña para una Artemia entera, corte la Artemia con un bisturí y alimente las piezas más pequeñas de Hydra . Si la Artemia no permanece dentro de la Hidra , puede ser necesario presionar la pinza contra la Artemia para mantenerla dentro de la Hidra hasta que su boca se cierre. </li></ol></li><li> Transferir Hydra alimentado con una pipeta Pasteur de vidrio, con cuidado para evitar el eructo accidental, a un plato con rifampicina 50 μg / ml fresco en medio Hydra . Si una Artemia fue expulsada fRom el Hydra mientras que transfiere, reinsértelo mientras que en el nuevo plato. Nota: Una pipeta de vidrio se utiliza para transferir la Hydra , ya que se ha encontrado que Hydra palo menos al vidrio en comparación con el plástico. La longitud de la pipeta no importa, pero el uso de pipetas de 5 pulgadas puede ser algo más fácil. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Burpe la Hidra para eliminar el material no digerido en cualquier momento entre 8 y 20 h después de la alimentación. </li><li> Lijar el punto de una aguja hipodérmica 30G con P320 o papel de lija de grano similar hasta que la punta esté plana. Nota: Una aguja hipodérmica 27G también funcionaría, pero la punta más pequeña del calibre más alto es preferible. </li><li> Sujete la aguja a una jeringa de plástico de 1 ml desechable y llene la jeringa con rifampicina fresca de 50 μg / mL en medio Hydra . Nota: Burping una sola Hydra toma aproximadamente 0.05 mL a 0.1 mL de la solución. A 1 mL de syriNge es preferible ya que controlar la fuerza y ​​el volumen de la solución que sale es más difícil con una jeringa de volumen más grande. </li><li> Bajo un microscopio de disección, sostenga el pedúnculo de la Hidra con pinzas de punta fina y toque en el centro del hipostótomo con la aguja. Si la boca no se abre, inserte fórceps en el hiposuero y abra la boca como se describe anteriormente para la alimentación. Nota: Todos los pasos posteriores se realizan bajo un microscopio de disección. </li><li> Utilice la jeringa para enjuagar, muy suavemente, para evitar que el animal soplado, la cavidad gástrica con la solución de rifampicina 50 μ g / mL hasta que todos los desechos ha sido expulsado. La aguja no necesariamente tiene que ser insertada en la Hydra si el tamaño de la Hydra no lo permite. La aguja puede mantenerse cerca de la abertura de la boca y apuntar directamente hacia la boca. </li><li> Utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio, transferir Hydra burped a un plato con 50 frescos81; g / mL rifampicina en medio de Hydra . </li></ol> 4. Control de calidad mediante inmunohistoquímica NOTA: El siguiente protocolo se adapta a partir de protocolos por Shenk, M. A, et al. 18 , y Böttger, A 19 . Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario. Un nutator se puede utilizar para las etapas de incubación y puede mejorar la calidad de tinción. Sin embargo, si la Hydra se enreda entre sí, todos los pasos también se pueden realizar sin. <ol><li> Preparar la solución de bloqueo: 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de DMSO en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). Guarde esta solución a 4 ° C hasta su uso (pasos 4.6 y 4.11). La solución se puede almacenar durante 1 - 2 días. Nota: Todas las soluciones utilizadas en este protocolo deben ser recogidas correctamente como residuos peligrosos. </li><li> Relax Hydra en 200 μl de uretano al 2% en Hydra mEdium durante 1 minuto en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Utilice 5 Hydra por tubo para cada una de las 4 condiciones: sin nervio, sin tratamiento, sin tratamiento sin anticuerpo primario y sin tratamiento sin anticuerpo secundario. Nota: No exceda de 1 min. El momento aquí es crítico ya que los animales estarán en mal estado después de pasar demasiado tiempo en uretano. </li><li> Retirar el uretano y fijar la Hidra en 200 μl de paraformaldehído (PFA) al 4% en medio Hydra durante 15 min. </li><li> Lavar las muestras 3 veces con 1x PBS durante 10 min cada una. Nota: Todos los lavados con PBS y PBSTx se hacen con 500 μl de solución. </li><li> Permeabilizar con 500 μl de Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 min. </li><li> Eliminar el 0,5% de Triton X-100 y agregar 500 μl de la solución de bloqueo. Bloquear las muestras durante al menos 1 h. </li><li> Diluir el anticuerpo anti-tirosina-tubulina 1: 200 en solución de bloqueo. Nota: Esta concentración fue laTerminada experimentalmente. Si se detecta que la señal en los controles es demasiado débil, puede ser necesario aumentar la concentración. Si hay unión no específica, puede ser necesario disminuir la concentración. La preincubación del anticuerpo también puede ayudar a reducir la unión no específica. </li><li> Retire la solución de bloqueo de las muestras y añada 200 μl del anticuerpo primario a los controles sin tratar de Hydra sin nervio y controles sin tratamiento sin secundaria. Para los controles no tratados sin primario, sólo añadir 200 μ l de solución de bloqueo sin el anticuerpo. </li><li> Incubar las muestras durante la noche (&gt; 12 h) a 4 ° C. Nota: Alternativamente, incubar 5 - 6 h a RT. </li><li> Eliminar el anticuerpo primario y lavar las muestras ampliamente con 0,3% de Triton X-100 en 1x PBS (PBSTx). Nota: Guarde el anticuerpo primario y guárdelo a 4 ° C, ya que puede reutilizarse al menos 2 - 3 veces. </li><li> Diluir cabra anti-ratón hP secundario antibOdy 1: 500 en solución de bloqueo. Agregue 200 μl a la Hydra sin nervio, controles no tratados y controles sin tratamiento sin primaria. Para los controles no tratados sin secundaria, sólo añadir 200 μ l de solución de bloqueo sin el anticuerpo. Nota: Alternativamente, puede usarse un anticuerpo secundario fluorescente, para lo cual no se necesitan los pasos 4.13 - 4.17. El uso de un secundario fluorescente ahorra tiempo y es generalmente adecuado, pero el secundario de hP proporciona mayor sensibilidad. La concentración de secundaria se determinó experimentalmente. Si se detecta que las señales en los controles son demasiado débiles, es posible que deba aumentar la concentración. Si hay unión no específica, puede ser necesario disminuir la concentración. </li><li> Incubar las muestras durante una noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar el anticuerpo secundario y lavar las muestras ampliamente con PBSTx. </li><li> Preparar 1x PBT: 0,2% de albúmina de suero bovino (peso / volumen) y 0,05% de Tween20 en 1x PBS. Incubar las sAmples en 1x PBT durante 30 min. </li><li> Eliminar el 1x PBT e incubar las muestras en 1: 1.000 NHS-fluoresceína y 1: 10.000 H 2 O 2 en 1x PBT durante 15 min en la oscuridad. A partir de este paso, mantener las muestras en la oscuridad, tanto como sea posible, ya que la señal fluorescente disminuirá a medida que se exponen a la luz. Nota: La NHS-fluoresceína se preparó siguiendo un protocolo FISH detallado por King, RS y Newmark, PA 20 </li><li> Lavar las muestras 3 veces con PBSTx rápidamente, luego 2 veces durante 30 min. </li><li> Dejar las muestras en PBSTx durante la noche a 4 ° C para continuar el lavado. </li><li> Haga algunos lavados más con 1x PBSTx. Para visualizar los núcleos celulares, lleve a cabo los siguientes pasos opcionales para la contra-tinción de ADN usando dihidrocloruro (DAPI) 4 &#39;, 6-diamindino-2-fenilindol. De lo contrario, las muestras pueden ser visualizadas ahora. </li><li> Diluir el stock DAPI de 5 mg / mL a una concentración de trabajo de 1: 500 en PBSTx y añadir 200 μl a cada tubo. IncuLas muestras durante 30 min. Precaución: DAPI es un carcinógeno conocido. Use PPE completo. </li><li> Retire el DAPI y lavar las muestras 2 - 3 veces con PBSTx antes de la formación de imágenes con microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las células intersticiales de la hidra pueden eliminarse mediante un tratamiento con doble colchicina 3 , 4 . En los días siguientes al primer tratamiento, es crítico evitar el contacto entre Hydra individual para evitar la fusión de piezas de Hydra en Hydra deformado. Además, los animales que pueden comer sin ayuda después del primer tratamiento deben ser eliminados ya que el segundo tratamiento con colchicina ...

El sistema nervioso de Hydra consiste en una red nerviosa, con neuronas asociadas con ambas capas de tejido epitelial 1 . La red nerviosa es más densa en el hypostome y pedúnculo y menos densa en la columna corporal 2 . Las células nerviosas se originan a partir de células madre intersticiales, que son células madre multipotentes que dan lugar a células secretoras, nematocitos, células germinales y neuronas 1 . Es posible eliminar las células intersticiales de Hydra vulgaris a través del tratamiento con colchicine 3 , 4 , una toxina derivada de plantas que mata a las células en división. Aunque se ha encontrado que la colchicina inhibe la polimerización de microtúbulos en otros organismos, un estudio previo ha demostrado que los microtúbulos están presentes en Hydra durante todo el tratamiento, lo que sugiere que la colchicina no actúa de esta manera en Hydra 3 . OtraUdy sugiere que la colchicina no se une eficazmente a la tubulina en algunos organismos, incluyendo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas y Schizosaccharomyces pombe, lo que puede explicar esta diferencia 5 . El tratamiento con colchicina induce la fagocitosis de las células intersticiales por las células epiteliales endodérmicas 3 y permite así la creación de animales que carecen de células nerviosas, glándulas y nematocitos. No está claro por qué las células intersticiales son particularmente susceptibles al tratamiento con colchicina. Dado que tanto las células intersticiales post-mitótico y el linaje de las células madre intersticiales están dañados y fagocitados, Campbell llegó a la conclusión de que la colchicina no estaba afectando directamente a la actividad mitótica [ 3] . En particular, el tratamiento con colchicina funciona bien en Hydra vulgaris, pero se ha demostrado que no funciona tan bien en otras especies, como Hydra oligactis 6 . </Em&gt; Un tratamiento modificado con colchicina e hidroxiurea puede ser utilizado para producir Hydra viridis libre de nervios 7 . La Hydra libre de nervios (también denominada a veces &quot; Hydra epitelial&quot; 8 ) es por lo tanto una herramienta útil para estudiar las funciones de estos tipos celulares especializados del linaje celular intersticial en la homeostasis y regeneración de los tejidos. Hydra puede ser el único ejemplo conocido de un animal capaz de vivir sin un sistema nervioso. La hidra libre de nervios sirve como un modelo particularmente útil para diseccionar el papel de la red nerviosa en la regulación de la regeneración, la homeostasis y el comportamiento de la hidra . Por ejemplo, la introducción de células intersticiales en la hidra libre de nervios a través de injerto permitió la caracterización de la diferenciación de las células nerviosas como altamente específica de la región [ 9] . Además, debido a que la hidra libre de nervios puede regenerarse,Permitir la investigación de alternativas, sistema nervioso independiente de las vías de regeneración. Un ejemplo de ello es la neurogénesis apical y la formación de la cabeza, que se ha demostrado que dependen de la función cnox-2 en el sistema nervioso en el Hydra de tipo silvestre, pero parece ser dispensable en Hydra libre de nervios, sugiriendo que puede haber un proceso alternativo de regeneración de la cabeza 10 . Hidra libre de nervios también se han utilizado para estudiar la expresión de células epiteliales y la regulación de genes neurogénicos y neurotransmisión después de la pérdida de la neurogénesis [ 11] . La Hidra libre de nervios no exhibe ráfagas de contracción espontánea 12 , lo que indica que estas ráfagas están reguladas por el sistema nervioso. Sin embargo, la hidra libre de nervios se contrae en respuesta a pellizcar la columna del cuerpo con fórceps, lo que sugiere que la contracción en respuesta a estímulos mecánicos está mediada por el acoplamientoGh hueco en las células epiteliales, mientras que el comportamiento contractil espontáneo es mediada por el acoplamiento a través de las uniones gap en las células nerviosas [ 13] . La Hidra libre de nervios no abre la boca cuando se les presenta con alimentos o glutatión 3 reducido, lo que sugiere que las neuronas sensoriales son necesarias para detectar la presencia de alimentos y señalar la boca para abrir. Además, la red nerviosa parece desempeñar un papel en la detección de la presión osmótica, ya que los animales libres de nervios son incapaces de regular autónomamente su presión hidrostática interna a través de la apertura de la boca, causando su aspecto característico de globo 3 , 4 . La regulación de la presión hidrostática en la hidra libre de nervios mediante una deflación manual frecuente condujo a la pérdida de alguna morfología anormal en el hiposuero y la columna corporal. Sin embargo, la deflación crónica condujo a la interferencia con el crecimiento, elCión, brotación y organización de los tejidos 8 . Aunque la hidra libre de nervios es incapaz de alimentarse y egestar por sí misma, es posible mantenerlos indefinidamente en el laboratorio mediante la alimentación manual y la eructación de cada animal. Las publicaciones anteriores han descrito métodos de alimentación forzada y eructos de la hidra libre de nervios, sin embargo estos protocolos implicaron el uso de puntas de micropipeta que deben ser tiradas con cuidado al tamaño apropiado así como el uso de una boquilla conectada a la pipeta por el tubo 14 . Aquí, se describe un método más simple, más seguro y más eficiente en tiempo de alimentación y eructos. Además, los estudios previos implicaron la comprobación de la ausencia de células nerviosas a través de la disociación de animales fijos en células individuales y el examen de la morfología celular [ 3 , 4 , 15] . MARIDOAntes, se utilizó inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal contra el extremo carboxilo tirosinado de la alfa-tubulina como método complementario de maceración para comprobar el agotamiento de las neuronas en el hipostómetro 13 , 16 . Estudios anteriores han demostrado que las neuronas en el pedúnculo también se pueden visualizar utilizando este anticuerpo 13 , sin embargo estas neuronas, así como los de la columna del cuerpo son más difíciles de hacer. Si bien la inmunohistoquímica es suficiente para confirmar la ausencia de células nerviosas en el hipostómetro y no requiere experiencia en la morfología del tipo celular, no puede utilizarse para comprobar la ausencia de las células madre intersticiales y las otras derivadas de estas células. Los estudios de disociación y morfología celular son más rigurosos y pueden dar una cuenta cuantitativa de los números de cada tipo de células restantes después de cada etapa del tratamiento.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

El linaje celular intersticial de Hydra incluye células madre multipotentes, y sus derivados: células de las glándulas, nematocitos, células germinales y células nerviosas. Las células intersticiales se pueden eliminar a través de dos tratamientos consecutivos con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, eliminando así el potencial de renovación de las células diferenciadas que se derivan de las células madre intersticiales. Esto permite la generación de Hydra que carecen de células nerviosas. Un pólipo libre de nervios no puede abrir su boca para alimentar, egestar o regular la presión osmótica. Estos animales, sin embargo, pueden sobrevivir y ser cultivados indefinidamente en el laboratorio si se alimentan regularmente con fuerza y ​​eructaron. La falta de células nerviosas permite estudiar el papel del sistema nervioso en la regulación del comportamiento animal y la regeneración. Los protocolos publicados previamente para el mantenimiento de Hydra sin nervios implican técnicas anticuadas, como la pipeta de boca con micropipeta manualIps para alimentar y limpiar la Hydra . Aquí, se introduce un protocolo mejorado para el mantenimiento de la hidra libre de nervios. Pinzas de punta fina se utilizan para forzar la apertura de la boca e insertar recién muertos Artemia . Después de la alimentación forzada, la cavidad corporal del animal se limpia con un medio fresco utilizando una jeringuilla y una aguja hipodérmica para retirar el material no digerido, denominado aquí &quot;eructo&quot;. Este nuevo método de alimentación forzada y eructar a la hidra sin nervios mediante el uso de fórceps y jeringas elimina la necesidad de pipetear la boca usando puntas de micropipeta tiradas a mano. Por lo tanto, hace que el proceso más seguro y significativamente más tiempo eficiente. Para asegurar que las células nerviosas en el hypostome han sido eliminadas, inmunohistoquímica utilizando anti-tirosina-tubulina se lleva a cabo.

Inmediatamente después del tratamiento inicial con 8 h de colchicina, todos los Hydra sobreviven. Algunas de estas Hidra sólo tendrán restos de tentáculos ( Figura 3 A ), mientras que otras habrán perdido completamente sus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante los siguientes 1 ó 2 días, los tentáculos seguirán disminuyendo hasta que todos los Hydra hayan perdido...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

A través de un doble tratamiento con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, Hydra vulgaris libre de nervios puede ser generado. Estos Hydra no puede alimentar o egest en sus los propios. Este artículo describe un método mejorado para el mantenimiento a largo plazo de Hydra vulgaris libre de nervios en el laboratorio.

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.4K vistas.  UC San Diego.  A través de un doble tratamiento con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, Hydra vulgaris libre de nervios puede ser generado. Estos Hydra no puede alimentar o egest en sus los propios. Este artículo describe un método mejorado para el mantenimiento a largo plazo de Hydra vulgaris libre de nervios en el laboratorio. 

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Neurociencias

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Bioingeniería

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generación de transgénicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinyección de embriones

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofección eficiente de NSCs aisladas de la zona subventricular murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Nucleofección mejorada para la entrega de genes de alta eficiencia en cultivos de células madre neurales derivadas de la zona subventricular murin

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios

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