Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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Gli autori ringraziano il dottor Dick Campbell (UC Irvine) per discutere del protocollo originale per la generazione e il mantenimento di animali privi di nervi, la sig.ra Rui Wang per aiutare ad adattare la siringa e la tecnica dell&#39;ago, e la signora Danielle Hagstrom e il dottor Rob Steele (UC Irvine) per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da RCSA e NSF concedere CMMI-1463572.

1. Doppia Colchicina Trattamento <ol><li> Fai una soluzione colchicina del 0.4% (peso / volume) in Hydra medium 3 , 4 , 17 . Attenzione: La colchicina è acutamente tossica, fatale se ingerita, può causare difetti genetici e può causare danni agli occhi. Maneggiare la polvere in un cappuccio e portare l&#39;attrezzatura protettiva personale (PPE) completa. </li><li> Incubato Hydra vulgaris (il ceppo AEP è stato usato qui) che sono stati affamati per 24 ore in colchicina 0,4% in un rapporto di 5 Idra per ml di soluzione colchicina in un piatto di Petri per 8 ore a temperatura ambiente al buio. Nota: 5 L&#39; idra / ml colchicina è una linea guida per determinare la quantità di soluzione da utilizzare per evitare sovraffollature del piatto con Hydra . Utilizzare lo stesso volume di soluzione per le successive pulizie e le modifiche della soluzione. </li><li> Rimuovere la soluzione colchicina e sostituireCon il mezzo pulito Hydra senza colchicina. Lavare l&#39; Hydra 5 volte per trasferimento seriale con una pipetta di Pasteur di vetro in un mezzo di Hydra pulito prima di trasferirlo a 50 μg / mL rifampicina in mezzo Hydra . Tenere l&#39; idra in un incubatore a 18 ° C. Nota: Una quantità sufficiente di rifampicina da 1000X (50 mg / mL) in dimetilsolfossido (DMSO) per 1-2 settimane di trattamento può essere conservata a 4 ° C. L&#39;importo esatto può essere determinato dal volume totale di soluzione utilizzata ogni giorno. Ad esempio, se ci sono 2 piatti, ognuno dei quali contiene 10 ml di soluzione che deve essere cambiato due volte al giorno, un totale di 40 ml di soluzione sarà utilizzato in un giorno, corrispondente a 40 μL di scorte di 1000X al giorno o di 560 μL Durante un periodo di due settimane. Lo stock è quindi diluito 1: 1000 in mezzo Hydra dopo l&#39;uso. Attenzione: DMSO è un liquido combustibile e penetra facilmente la pelle, permettendo ad altri prodotti chimici disciolti nel corpo. ManoIl solvente in una cappa di fumo e indossare il PPE completo. Da notare, DMSO si blocca a 4 ° C </li><li> Cambiare il medesimo Hydra contenente rifampicina due volte al giorno finché l&#39; idra non espelle le cellule nel mezzo, generalmente dopo un trattamento post-settimana. A questo punto, il mezzo può essere cambiato una volta al giorno. Durante i giorni successivi al trattamento, l&#39; Hydra perderà completamente i tentacoli. Evitate di avere l&#39; Hydra in contatto tra loro, in quanto potrebbero fondersi e provocare Idra di forma stranamente formata ( Figura 2 A ). <ol><li> Per prevenire il contatto, evitare di roteare il piatto in un movimento circolare. Invece agitare delicatamente il piatto in direzioni verticali e orizzontali finché l&#39; idra non si distribuisce a parte. Ispezionare il piatto dopo aver posizionato l&#39; Hydra nell&#39;incubatrice a 18 ° C e regolare se necessario. Nota: nei giorni in cui il supporto viene modificato due volte, cambiare il supportoUna volta al mattino e ancora nel pomeriggio / sera. </li></ol></li><li> Una volta che i tentacoli iniziano a formarsi, iniziare a forzare l&#39;alimentazione e burping l&#39; Hydra 3 a 4 volte a settimana (vedere Sezioni 2 e 3). Circa 8-9 giorni dopo il trattamento con colchicina, l&#39; Hydra comincerà a crescere i tentacoli. Nota: La ricrescita del tentennino varia tra gli individui. Alcuni possono richiedere più di 8 - 9 giorni prima di mostrare segni di crescita tentacolare. Quelli che non ricrescono i loro tentacoli e gli animali o animali troppo piccoli da alimentare ( Figura 2 B ), devono essere rimossi. Questi Hydra probabilmente non sopravvivere al secondo trattamento. L&#39; idra può anche germogliare. Tuttavia, alcuni dei germogli possono ancora avere cellule interstiziali e poter mangiare da sola. <ol><li> Rimuovere tutti i germogli che possono mangiare senza assistenza e staccarsi dall&#39;animale genitore. Individuare questi animali aggiungendo Artemia dal vivo alMangiando piatto e osservando se gli animali catturano e mangiano l&#39; Artemia da soli. 1 o 2 Hydra può anche mangiare in proprio. Questi dovrebbero essere scartati. Nota: l&#39; Idra priva di nervi ha una caratteristica morfologia simile a palloncini, e tentacoli più corti e più sottili rispetto alla normale (a causa della perdita di nematociti) e possono quindi essere facilmente distinti da animali normali ( Figura 1 A, 1B ). </li></ol></li><li> Tre settimane dopo il primo trattamento della colchicina, ripetere il trattamento della colchicina (passaggi 1.1 - 1.5). È necessario un secondo trattamento colchicina per eliminare le restanti cellule interstiziali e le cellule nervose 3 . </li></ol> 2. Forza-alimentazione <ol><li> Aggiungere cisti di Artemia ad un contenitore di vetro stretto e alto che si aggrappa in basso. Riempire il contenitore con acqua di Artemia (6.72 M NaCl). Evita di uscireCon 1 g di cisti per 1 L di acqua per una resa più elevata. <ol><li> Coprire la parte superiore del contenitore con il parafilm e inserire una pipetta serologica da 10 ml attraverso il parafilm nel contenitore. Fornire l&#39;aerazione collegando il tubo ad una pompa dell&#39;aria dell&#39;acquario e montando il tubo attorno alla pipetta. Assicurarsi che la punta della pipetta raggiunga il fondo del contenitore e che non ci siano cisti al fondo. L&#39; Artemia sbarcherà dopo 48 h. Nota: Ci sono molti modi diversi per aprire Artemia che può funzionare altrettanto bene. </li></ol></li><li> Togliere l&#39; Artemia dall&#39;acqua di Artemia in una rete Artemia (disponibile presso le società di approvvigionamento di acquari) e lavare per circa 20 s in acqua di DI, prima di piazzarli in un piatto con il mezzo di Hydra . La salinità dell&#39;acqua di Artemia è troppo elevata per Hydra , quindi la Artemia deve essere lavata prima di essere utilizzata. </li><li> Sotto un microscopio di dissezione,Eutanizzano l&#39; Artemia leggendolo spremendolo con un paio di pinze fine. Evitare di spremere abbastanza duro per espellere il budello, poiché questo si attacca alle pinze e rende difficile l&#39;alimentazione. Leggermente schiacciando l&#39; Artemia prima di alimentarla all&#39;Hydra aiuterà con il processo di digestione 14 . Posizionare l&#39; Artemia appena ucciso vicino all&#39;Hydra nel piatto per facilitare l&#39;alimentazione veloce. Nota: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti con un microscopio di dissezione. </li><li> Utilizzare una coppia di pinze per tenere l&#39; idra dal peduncolo. Continuare a tenere il peduncolo durante il processo di alimentazione dell&#39;Hydra . Utilizzando una seconda coppia di pinze, pizzicare la colonna del corpo per fare il contratto Hydra . </li><li> Tenendo insieme le punte della seconda coppia di pinze, toccate al centro del hypostome (la struttura a cupola all&#39;estremità orale dell&#39;animale). Questo a volte apre la bocca. ioLa bocca non si apre premendo, punzonare la bocca inserendo la pinza nel centro del hypostome e quindi rilasciare leggermente la pressione sulle punte della pinza. Questo dovrebbe allungare l&#39;apertura della bocca fatta dalla puntura. Nota: l&#39; idra può sgonfiarsi e collassare quando la bocca è aperta ( Figura 2 C ). Se ciò accade, l&#39; Artemia può essere ancora inserita nell&#39;Hydra . Se è troppo difficile farlo, passare alla prossima Hydra e tornare all&#39;Hydra originale più tardi e riprovare. L&#39; idra tendono a non sgonfiare tanto durante le successive aperture della bocca. </li><li> Raccogli rapidamente Artemia con le pinze e inserirle nella cavità gastrica dell&#39;Hydra . Inserisci il maggior numero possibile di Artemia fino a quando la cavità gastrica è piena e più Artemia non può essere inserita senza danneggiare l&#39; Hydra , l&#39;incidenteAlleati che tira fuori qualsiasi Artemia , o impedisce la chiusura della bocca. In media, questa è 5 - 6 Artemia , tuttavia fino a 12 sono stati alimentati agli animali più grandi. <ol><li> Se la bocca inizia a chiudere, allungare nuovamente con le pinze come sopra descritto; Tuttavia, si dovrebbe prendere precauzione come qualunque Artemia già dentro l&#39;animale possa cominciare a uscire quando la bocca è riaperta. </li><li> Se l&#39; Hydra è troppo piccola per un&#39;intera Artemia , tagliare l&#39; Artemia usando un bisturi e alimentare i pezzi più piccoli Hydra . Se l&#39; Artemia non rimane all&#39;interno dell&#39;Hydra , potrebbe essere necessario premere la pinza contro l&#39; Artemia per mantenerlo all&#39;interno dell&#39;Hydra fino alla sua chiusura della bocca. </li></ol></li><li> Trasferire l&#39; idra alimentata con una pipetta di Pasteur di vetro, attentamente per evitare burping accidentale, ad un piatto con rifampicina fresca 50 μg / mL in mezzo Hydra . Se un&#39;Artemia è stata espulsa fRom l&#39; idra durante il trasferimento, reinserirlo mentre nel nuovo piatto. Nota: una pipetta di vetro viene utilizzata per il trasferimento dell&#39;Hydra , in quanto si è riscontrato che Hydra non è più a vetro rispetto alla plastica. La lunghezza della pipetta non importa, ma utilizzando pipette da 5 pollici può essere un po &#39;più facile. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Far scorrere l&#39; Hydra per rimuovere il materiale non immerso in qualsiasi momento tra 8 e 20 ore dopo l&#39;alimentazione. </li><li> Sabbia il punto di un ago ipodermico da 30G con P320 o carta simile a graniglia fino a quando la punta è piatta. Nota: Un ago ipodermico 27G funzionerebbe anche, ma la punta più piccola del manometro superiore è preferibile. </li><li> Attaccare l&#39;ago ad una siringa di plastica monouso da 1 ml e riempire la siringa con fresca rifampicina 50 μg / mL in mezzo Hydra . Nota: il burping di una singola idra richiede circa 0,05 ml a 0,1 ml di soluzione. A 1 ml di syriNge è preferibile poiché è più difficile controllare la forza e il volume della soluzione uscente con una siringa di volume maggiore. </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, tenere il peduncolo dell&#39;Hydra con pinze fine punto e toccare al centro del hypostome con l&#39;ago. Se la bocca non si apre, inserire le pinze nel hypostome e aprire la bocca come descritto sopra per l&#39;alimentazione. Nota: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti con un microscopio di dissezione. </li><li> Utilizzare la siringa per sciacquare, molto dolcemente, per evitare di soffiare l&#39;intero animale, la cavità gastrica con la soluzione di rifampicina da 50 μg / mL fino a quando tutti i detriti sono stati espulsi. L&#39;ago non deve necessariamente essere inserito nell&#39;Hydra se la dimensione dell&#39;Hydra non lo consente. L&#39;ago può essere tenuto vicino all&#39;apertura della bocca e punta direttamente verso la bocca. </li><li> Utilizzando una pipetta di Pasteur di vetro, trasferire Hydra burped a un piatto con 50 freschi81; g / mL rifampicina in mezzo Hydra . </li></ol> 4. Controllo della qualità attraverso l&#39; immunohistochemistry NOTA: Il seguente protocollo è adattato dai protocolli di Shenk, M. A, et al. 18 , e Böttger, A 19 . Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT), salvo diversa indicazione. Un nutatore può essere utilizzato per le fasi di incubazione e può migliorare la qualità di colorazione. Tuttavia, se l&#39; Hydra si aggrappa l&#39;uno con l&#39;altro, tutti i passaggi possono anche essere eseguiti senza. <ol><li> Preparare la soluzione di blocco: 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% DMSO in 1x salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare questa soluzione a 4 ° C fino all&#39;uso (punti 4.6 e 4.11). La soluzione può essere conservata per 1 - 2 giorni. Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in questo protocollo devono essere raccolte correttamente come rifiuti pericolosi. </li><li> Rilassare Hydra in 200 μl di uretano al 2% in Hydra mPer 1 min in 1,7 mL di microcentrifuga. Utilizzare 5 idrati per tubo per ciascuna delle 4 condizioni: senza nervo, non trattato, non trattato con nessun anticorpo primario e non trattato con nessun anticorpo secondario. Nota: non superare 1 min. Il tempo qui è critico poiché gli animali saranno in cattive condizioni dopo aver trascorso troppo tempo in uretano. </li><li> Rimuovere l&#39;uretano e fissare l&#39; idra in 200 μl di 4% di paraformaldeide (PFA) in media di Hydra per 15 minuti. </li><li> Lavare i campioni 3 volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno. Nota: tutte le liscive con PBS e PBSTx vengono fatte con 500 μL di soluzione. </li><li> Permeabilizzare con 500 μl di 0,5% di Triton X-100 in PBS per 15 minuti. </li><li> Rimuovere lo 0,5% di Triton X-100 e aggiungere 500 μL della soluzione di blocco. Bloccare i campioni per almeno 1 h. </li><li> Diluire l&#39;anticorpi anti-tirosina-tubulina 1: 200 nella soluzione di blocco. Nota: questa concentrazione era deTerminato sperimentalmente. Se il segnale nei controlli è risultato troppo debole, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione. Se vi è un legame non specifico, la concentrazione può essere necessaria per essere ridotta. La preincubazione dell&#39;anticorpo può anche contribuire a ridurre il legame non specifico. </li><li> Rimuovere la soluzione di blocco dai campioni e aggiungere 200 μL dell&#39;anticorpo primario ai controlli non trattati e ai controlli non trattati senza nessun secondario. Per i controlli non trattati senza primaria, solamente aggiungere 200 μL di soluzione di blocco senza l&#39;anticorpo. </li><li> Incubare i campioni durante la notte (&gt; 12 h) a 4 ° C. Nota: In alternativa, incubare 5 - 6 h a RT. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo primario e lavare ampiamente i campioni con lo 0,3% di Triton X-100 in 1x PBS (PBSTx). Nota: Salvare l&#39;anticorpo primario e conservare a 4 ° C, poiché può essere riutilizzato almeno 2 - 3 volte. </li><li> Anti-mouse anti-mouse hP secondario anti-topo diluitoOdy 1: 500 in soluzione di blocco. Aggiungere 200 μL ai controlli non trattati Hydra senza nervi e controlli non trattati senza primaria. Per i controlli non trattati senza secondario, aggiungere solo 200 μL di soluzione di blocco senza l&#39;anticorpo. Nota: In alternativa, è possibile utilizzare un anticorpo secondario fluorescente, per i quali non sono necessari i punti 4.13 - 4.17. L&#39;utilizzo di un secondario fluorescente consente di risparmiare tempo e generalmente è sufficiente, ma la secondaria hP fornisce una maggiore sensibilità. La concentrazione di secondaria è stata determinata sperimentalmente. Se i segnali nei controlli si trovano troppo deboli, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione. Se vi è un legame non specifico, la concentrazione può essere necessaria per essere ridotta. </li><li> Incubare i campioni durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo secondario e lavare ampiamente i campioni con PBSTx. </li><li> Preparare 1x PBT: l&#39;albumina di siero bovina 0,2% (peso / volume) e 0,05% Tween20 in 1x PBS. Incubare la sAmpli in 1x PBT per 30 min. </li><li> Rimuovere il 1x PBT e incubare i campioni in 1: 1.000 NHS-fluoresceina e 1: 10.000 H 2 O 2 in 1x PBT per 15 minuti al buio. Da questo passo, tenere i campioni nel buio il più possibile, in quanto il segnale fluorescente diminuirà in quanto sono esposti alla luce. Nota: Fluoresceina NHS è stata preparata seguendo un protocollo FISH dettagliato da King, RS e Newmark, PA 20 </li><li> Lavare i campioni 3 volte con PBSTx rapidamente, quindi 2 volte per 30 min. </li><li> Lasciare i campioni in PBSTx per una notte a 4 ° C per continuare a lavare. </li><li> Fare qualche lavaggio più con 1x PBSTx. Per visualizzare i nuclei cellulari, eseguire le seguenti fasi facoltative per il conteggio del DNA utilizzando 4 &#39;, 6-diamindino-2-fenilindolo, dihydrochloride (DAPI). In caso contrario, i campioni possono essere imaged ora. </li><li> Diluire la massa di DAPI da 5 mg / ml a una concentrazione di lavoro di 1: 500 in PBSTx e aggiungere 200 μL ad ogni tubo. incuBalla i campioni per 30 min. Attenzione: DAPI è un cancerogeno noto. Indossare il PPE completo. </li><li> Rimuovere il DAPI e lavare i campioni 2 - 3 volte con PBSTx prima di imaging con microscopia a fluorescenza. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le cellule interstiziali Idra possono essere eliminate tramite un doppio trattamento con colchicina 3 , 4 . Nei giorni successivi al primo trattamento, è fondamentale impedire il contatto tra l&#39; idra individuale per evitare la fusione di pezzi Hydra in idra deformata. Inoltre, gli animali che possono mangiare non assistiti dopo il primo trattamento devono essere rimossi in quanto il secondo trattamento della colc...

Il sistema nervoso di Hydra è costituito da una rete nervosa, con i neuroni associati a entrambi gli strati di tessuto epiteliale 1 . La rete nervosa è più densa nel hypostome e nel peduncolo e meno densa nella colonna del corpo 2 . Le cellule nervose provengono da cellule staminali interstiziali, che sono cellule staminali multipotenti che danno origine a cellule secretarie, nematociti, cellule germinali e neuroni 1 . È possibile eliminare le cellule interstiziali di Hydra vulgaris attraverso il trattamento con colchicina 3 , 4 , una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie. Anche se la colchicina è stata trovata per inibire la polimerizzazione del microtubulo in altri organismi, uno studio precedente ha dimostrato che i microtubuli sono presenti in Hydra per tutto il trattamento, suggerendo che la colchicina non agisce in Hydra 3 . Un altro stUdy suggerisce che la colchicina non lega efficacemente la tubulina in alcuni organismi, tra cui Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, che possono spiegare questa differenza 5 . Il trattamento della colchicina induce la fagocitosi delle cellule interstiziali dalle cellule epiteliali endodermiche 3 e consente quindi la creazione di animali che mancano di cellule nervose, di cellule ghiandolari e nematociti. Non è chiaro perché le cellule interstiziali siano particolarmente sensibili al trattamento della colchicina. Dato che entrambe le cellule interstitiali post-mitotiche e le cellule delle cellule staminali interstiziali sono danneggiate e fagocitose, Campbell ha concluso che la colchicina non influiva direttamente l&#39;attività mitotica 3 . In particolare, il trattamento colchicina funziona bene in Hydra vulgaris, ma è stato dimostrato di non funzionare anche in altre specie, come Hydra oligactis 6 . </Em&gt; Un trattamento modificato con colchicina e idrossiacido può essere utilizzato per produrre Idra viridis 7 privo di nervi. Idra priva di nervi (anche a volte definita come &quot; Hydra epiteliale&quot; 8 ) sono quindi uno strumento utile per studiare i ruoli di questi tipi di cellule specializzate dalla linea di cellule interstitiali nell&#39;omeostasi tissutale e nella rigenerazione. L&#39;idra può essere l&#39;unico esempio noto di un animale capace di vivere senza un sistema nervoso. Idra priva di nervi servono come un modello particolarmente utile per dissectare il ruolo della rete nervosa nella regolazione della rigenerazione idraulica , dell&#39;omeostasi e del comportamento. Ad esempio, l&#39;introduzione di cellule interstiziali in Idra priva di nervi tramite innesto ha permesso di caratterizzare la differenziazione delle cellule nervose come regione altamente specifica 9 . Inoltre, perché l&#39; Idra priva di nervi può rigenerarsiConsentire l&#39;indagine di percorsi alternativi di rigenerazione indipendenti dal sistema nervoso. Un esempio di questo tipo è la neurogenesi apicale e la formazione delle teste, che è stato dimostrato dipendente dalla funzione cnox-2 nel sistema nervoso di tipo idrico tipico , ma sembra essere dispensabile in Idra priva di nervi, suggerendo che ci possa essere un processo alternativo di rigenerazione della testa 10 . Hydra senza nervi sono stati utilizzati anche per studiare l&#39;espressione delle cellule epiteliali e la regolazione dei geni neurogenici e neurotrasmettitori dopo la perdita della neurogenesi 11 . L&#39; Idra priva di nervi non presenta esplosioni spontanee di contrazione 12 , indicando che queste esplosioni sono regolate dal sistema nervoso. L&#39; Idra priva di nervi, invece, si contrae in risposta al pizzicamento della colonna corporea, suggerendo che la contrazione in risposta agli stimoli meccanici è mediata dall&#39;accoppiamentoGh junction in cellule epiteliali, mentre il comportamento contrattile spontaneo è mediato da accoppiamento attraverso giunzioni gap nelle cellule nervose 13 . Idra priva di nervi non apre le bocche quando viene presentata con cibo o ridotto glutatione 3 , suggerendo che neuroni sensoriali sono necessari per rilevare la presenza di cibo e segnalare la bocca da aprire. Inoltre, la rete nervosa sembra svolgere un ruolo nel rilevare la pressione osmotica, poiché gli animali privi di nervi non sono in grado di regolare autonomamente la loro pressione idrostatica interna attraverso l&#39;apertura della bocca, causando il loro aspetto simile al pallone 3 , 4 ( figura 1B ). La regolazione della pressione idrostatica in Hydra priva di nervi con una frequente deflazione manuale ha portato ad una perdita di qualche morfologia anormale nella colonna del hypostome e del corpo. Tuttavia, la deflazione cronica ha causato interferenze con la crescita, elOngation, germinazione e organizzazione dei tessuti 8 . Sebbene l&#39; idra priva di nervi non sia in grado di nutrirsi e di esplorare da soli, è possibile mantenerli a tempo indefinito in laboratorio mediante l&#39;alimentazione manuale a mano e burping ogni animale. Le pubblicazioni precedenti hanno descritto metodi di forza-alimentazione e burping Hydra senza nervi, tuttavia questi protocolli hanno coinvolto l&#39;uso di punte di micropipette che devono essere manualmente tirato con attenzione alla dimensione appropriata, nonché l&#39;uso di un boccaglio collegato alla pipetta da tubo 14 . Qui viene descritto un metodo più semplice, più sicuro e più efficiente nel tempo per l&#39;alimentazione e il burping. Inoltre, studi precedenti hanno coinvolto il controllo dell&#39;assenza di cellule nervose attraverso la dissociazione degli animali fissi in singole cellule e l&#39;esame della morfologia cellulare 3 , 4 , 15 . HL&#39;immunohistochemistry con un anticorpo monoclonale contro il terminale carbossilato tirosinato di alfa-tubulina è stato usato come metodo complementare alla macerazione per verificare l&#39;esaurimento dei neuroni nell&#39;ipostomo 13 , 16 . Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni nel peduncolo possono anche essere visualizzati utilizzando questo anticorpo 13 , tuttavia questi neuroni e quelli della colonna corporea sono più difficili da definire. Mentre l&#39;immunohistochemistry è sufficiente a confermare l&#39;assenza di cellule nervose nel hypostome e non richiede competenze sulla morfologia di tipo cellulare, non può essere utilizzato per verificare l&#39;assenza delle cellule staminali interstitiali e degli altri derivati ​​di queste cellule. Gli studi sulla dissociazione e sulla morfologia cellulare sono più rigorosi e possono dare un resoconto quantitativo dei numeri di ciascun tipo di cellula che rimangono dopo ogni fase del trattamento.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

La linea di cellule interstiziali di Hydra comprende cellule staminali multipotenti ei loro derivati: cellule ghiandolari, nematociti, cellule germinali e cellule nervose. Le cellule interstiziali possono essere eliminate mediante due trattamenti consecutivi con colchicina, una tossina derivata da piante che uccide le cellule divisorie, eliminando così il potenziale di rinnovamento delle cellule differenziate derivate dalle cellule staminali interstiziali. Ciò consente alla generazione di Hydra che mancano di cellule nervose. Un polipo privo di nervi non può aprire la bocca per alimentare, controllare o regolare la pressione osmotica. Tali animali, tuttavia, possono sopravvivere e essere coltivati ​​indefinitamente in laboratorio se regolarmente alimentati e burped. La mancanza di cellule nervose consente di studiare il ruolo del sistema nervoso nel regolare il comportamento e la rigenerazione degli animali. I protocolli precedentemente pubblicati per la manutenzione Idra libera da idrocarburi comprendono tecniche obsolete quali la pipettazione a bocca con micropipetta tirata a manoIps per alimentare e pulire l&#39; Hydra . Qui viene introdotto un miglioramento del protocollo per la manutenzione di Idra priva di nervi. Le pinze fine-punte vengono utilizzate per forzare la bocca e inserire Artemia appena uccisa. Dopo l&#39;alimentazione della forza, la cavità del corpo dell&#39;animale viene lavata con un mezzo fresco usando una siringa e un ago ipodermico per rimuovere il materiale non digerito, qui indicato come &quot;burping&quot;. Questo nuovo metodo di erogazione di forza e burping Hydra senza nervi attraverso l&#39;uso di pinze e siringhe elimina la necessità di pipettazione a bocca con punte a micropipetta tirate a mano. Questo rende il processo più sicuro e significativamente più tempo efficiente. Per garantire che le cellule nervose nel iostomo siano state eliminate, viene condotta l&#39;immunohistochemistry usando l&#39;anti-tirosina-tubulina.

Subito dopo il trattamento iniziale di 8 ore di colchicina, tutti i Hydra sopravvivono. Alcune di queste Hydra avranno solo stoppini tentacoli ( Figura 3 A ), mentre altri avranno completamente perso i tentacoli ( Figura 3 B ). Nei prossimi 1 o 2 giorni, i tentacoli continueranno a ridursi fino a quando tutti i Hydra hanno perso i tentacoli. Circa una settimana dopo il...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Attraverso un doppio trattamento con colchicina, può essere generata una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie, senza idrografia Hydra vulgaris . Questi Hydra non possono nutrire o esaminare da soli. Questo documento descrive un metodo migliorato per la manutenzione a lungo termine di Idra vulgaris privo di nervi in ​​laboratorio.

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.4K Views.  UC San Diego.  Attraverso un doppio trattamento con colchicina, può essere generata una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie, senza idrografia Hydra vulgaris . Questi Hydra non possono nutrire o esaminare da soli. Questo documento descrive un metodo migliorato per la manutenzione a lungo termine di Idra vulgaris privo di nervi in ​​laboratorio. 

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Neuroscienze

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Bioingegneria

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofecazione efficiente di NSC isolate dalla zona subventricolare murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Nucleofection migliorata per la consegna genica ad alta efficienza in colture di cellule staminali neurali munine derivate dalla zona subven

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi

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