Os autores agradecem ao Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por discussões sobre o protocolo original para gerar e manter animais sem nervos, a Sra. Rui Wang para ajudar a adaptar a seringa e a técnica da agulha, e a Sra. Danielle Hagstrom e o Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão RCSA e NSF CMMI-1463572.

1. Tratamento duplo de colchicina <ol><li> Faça uma solução de 0,4% de colchicina (peso / volume) em Hydra medium 3 , 4 , 17 . Cuidado: Colchicina é extremamente tóxica, fatal se ingerido, pode causar defeitos genéticos e pode causar danos nos olhos. Pegue o pó em uma chaminé e use equipamentos de proteção pessoal completos (PPE). </li><li> Incubar Hydra vulgaris (estirpe AEP aqui utilizada) que foram submetidos à privação durante 24 horas em 0,4% de colchicina na proporção de 5 Hydra por mL de solução de colchicina em uma placa de Petri durante 8 h à temperatura ambiente no escuro. Nota: 5 Hydra / mL colchicina é uma diretriz para determinar a quantidade de solução a ser utilizada para evitar o superlotação do prato com Hydra . Use o mesmo volume de solução para limitações subsequentes e mudanças na solução. </li><li> Remova a solução de colchicina e substituaCom meio de hidra limpo sem colchicina. Lave o Hydra 5 vezes por transferência serial com uma pipeta Pasteur de vidro para limpar o meio de Hydra antes de transferir para 50 μg / mL de rifampicina no meio de Hydra . Mantenha a Hidra em uma incubadora a 18 ° C. Nota: Pode ser armazenada uma quantidade suficiente de 1000 x rifampicina (50 mg / mL) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) durante 1-2 semanas de tratamento a 4 ° C. A quantidade exata pode ser determinada pelo volume total de solução utilizada a cada dia. Por exemplo, se houver 2 pratos, cada um contendo 10 mL de solução que precisa ser alterado duas vezes por dia, um total de 40 mL de solução será usado em um dia, correspondendo a 40 μL de estoque de 1000X por dia ou 560 μL Durante um período de duas semanas. O estoque é então diluído 1: 1000 em meio Hydra após o uso. Cuidado: O DMSO é um líquido combustível e penetra prontamente na pele, permitindo outros produtos químicos dissolvidos no corpo. MãoDeixe o solvente em uma exaustão e use PPE cheio. De notar, o DMSO congela a 4 ° C </li><li> Mude o meio de Hydra contendo rifampicina duas vezes por dia até o Hydra parar de expulsar as células para o meio, o que é geralmente por 1 semana após o tratamento. Neste ponto, o meio pode ser alterado uma vez por dia. Durante os dias que seguem o tratamento, a Hydra perderá completamente seus tentáculos. Evite que o Hydra entre em contato, uma vez que eles podem fundir-se e resultar em Hydra de forma estranha ( Figura 2 A ). <ol><li> Para evitar contato, evite rodar o prato em movimento circular. Em vez disso, agite suavemente o prato nas direções vertical e horizontal até o Hydra se espalhar. Inspecione o prato ao colocar a Hidra na incubadora a 18 ° C e ajuste conforme necessário. Observação: para os dias em que o meio é alterado duas vezes, mude o meioUma vez de manhã e novamente à tarde / à noite. </li></ol></li><li> Uma vez que os tentáculos começam a se formar, comece a forçar e eructar o Hydra 3 a 4 vezes por semana (ver Seções 2 e 3). Cerca de 8-9 dias após o tratamento com colchicina, o Hydra começará a desenvolver seus tentáculos de volta. Nota: O crescimento do tentáculo varia entre os indivíduos. Alguns podem demorar mais de 8 a 9 dias antes de mostrar sinais de crescimento do tentáculo. Aqueles que não regeneram seus tentáculos, bem como animais estranhos ( Figura 2 B ) ou animais muito pequenos para serem alimentados devem ser removidos. Esses Hydra provavelmente não sobreviverão ao segundo tratamento. A Hydra também pode brotar. No entanto, alguns dos botões podem ainda ter células intersticiais e poder comer por conta própria. <ol><li> Remova quaisquer botões que possam comer sem assistência e se separar do animal pai. Identifique esses animais adicionando Artemia ao vivo aoAlimentando o prato e observando se os animais pegarão e comerão o Artemia por conta própria. 1 ou 2 Hydra também podem comer por conta própria. Estes também devem ser descartados. Nota: A hidra sem nervos possui uma característica morfologia semelhante a um balão e tentáculos mais curtos e mais finos do que o normal (devido à perda de nematócitos) e, portanto, podem ser facilmente distinguidos dos animais com aparência normal ( Figura 1 A, 1B ). </li></ol></li><li> Três semanas após o primeiro tratamento com colchicina, repita o tratamento com colchicina (passos 1.1 - 1.5). Um segundo tratamento com colchicina é necessário para eliminar as células intersticiais remanescentes e as células nervosas 3 . </li></ol> 2. Força-Alimentação <ol><li> Adicione os cistos de Artemia a um recipiente de vidro estreito e alto que se afunde no fundo. Encha o recipiente com água de Artemia (NaCl 6,72 M). Evite exceCom 1 g de cistos por 1 L de água para um maior rendimento da escotilha. <ol><li> Cubra a parte superior do recipiente com parafilme e insira uma pipeta sorológica de 10 mL através do parafilme no recipiente. Forneça a aeração conectando tubos a uma bomba de ar do aquário e encaixando a tubulação em torno da pipeta. Certifique-se de que a ponta da pipeta alcance a parte inferior do recipiente e que nenhum cisto esteja instalado na parte inferior. O Artemia irá escotilhar depois das 48 h. Nota: Existem muitas maneiras diferentes de criar Artemia que pode funcionar tão bem. </li></ol></li><li> Coloque o Artemia da água Artemia em uma rede Artemia (disponível nas empresas de abastecimento de aquários) e lave-os por cerca de 20 s em água DI antes de colocá-los em um prato com meio Hydra . A salinidade da água de Artemia é muito alta para Hydra , então o Artemia deve ser lavado antes de serem usados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação,Euthanize o Artemia apertando-os ligeiramente com um par de pinças finas. Evite espremer com força o suficiente para expulsar as tripas, pois isso irá manter a pinça e dificultar a alimentação. Apertar ligeiramente o Artemia antes de alimentá-lo ao Hydra ajudará no processo de digestão 14 . Coloque o Artemia recentemente morto perto da Hidra no prato para facilitar a alimentação rápida. Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Use um par de pinças para segurar a Hydra pelo pedúnculo. Continue segurando o pedúnculo durante o processo de alimentação da Hydra . Usando um segundo par de fórceps, pitada a coluna do corpo para fazer o contrato Hydra . </li><li> Enquanto segura as pontas do segundo par de fórceps juntos, toque no centro do hipossetro (a estrutura em forma de abóbada na extremidade oral do animal). Isso, por vezes, faz com que a boca se abra. EuF a boca não abre batendo, perfure a boca, inserindo a pinça no centro do hipossetro e depois solte levemente a pressão nas pontas da pinça. Isso deve esticar a abertura da boca feita pela punção. Nota: O Hydra pode desinflar e desabar quando a boca é aberta ( Figura 2 C ). Se isso ocorrer, o Artemia ainda pode ser inserido no Hydra . Se é muito difícil fazê-lo, avance para o próximo Hydra e volte ao Hydra original um pouco mais tarde e tente novamente. A Hydra tende a não se esvaziar tanto durante as aberturas de boca subseqüentes. </li><li> Pegue rapidamente Artemia com a pinça e insira-os na cavidade gástrica da Hydra . Insira o máximo de Artemia possível até a cavidade gástrica estar cheia e mais Artemia não pode ser inserida sem danificar a Hidra , acidenteAliado retirando qualquer Artemia para dentro, ou impedindo que a boca se feche. Em média, isso é de 5 a 6 Artemia , no entanto, até 12 foram alimentados aos animais maiores. <ol><li> Se a boca começar a fechar, estique-se novamente com a pinça conforme descrito acima; No entanto, deve ser tomado cuidado, pois qualquer Artemia já dentro do animal pode começar a sair quando a boca é reaberta. </li><li> Se a Hydra é muito pequena para um Artemia inteiro, corte o Artemia usando um bisturi e alimente as peças menores da Hydra . Se o Artemia não ficar dentro da Hidra , pode ser necessário pressionar a pinça contra o Artemia para mantê-lo dentro da Hidra até sua boca se fechar. </li></ol></li><li> Transferir a Hydra alimentada com uma pipeta Pasteur de vidro, cuidadosamente para evitar eructos acidentais, em um prato com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra . Se um Artemia foi expulso fRom a Hydra enquanto se transfere, reinsira-a enquanto estiver no novo prato. Nota: Uma pipeta de vidro é usada para transferir a Hydra , pois descobriu que a Hydra se encaixou menos no vidro em comparação com o plástico. O comprimento da pipeta não importa, mas usar pipetas de 5 polegadas pode ser um pouco mais fácil. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Burp Hydra para remover material não digerido a qualquer momento entre 8 e 20 h após a alimentação. </li><li> Areia no ponto de uma agulha hipodérmica 30G com P320 ou papel de lixa de grão semelhante até a ponta ser plana. Nota: Uma agulha hipodérmica 27G também funcionaria, mas a ponta menor do calibre mais alto é preferível. </li><li> Anexe a agulha a uma seringa de plástico descartable de 1 mL e encha a seringa com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra . Nota: Burping One Hydra leva cerca de 0,05 mL a 0,1 mL de solução. Um syri de 1 mLNge é preferível, uma vez que o controle da força e do volume da solução que sai é mais difícil com uma seringa de volume maior. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, segure o pedúnculo da Hidra com fórceps finos e toque no centro do hipossetro com a agulha. Se a boca não abrir, insira fórceps no hiposstoma e abra a boca como descrito acima para alimentação. Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Use a seringa para nivelar, muito gentilmente, para evitar o afundamento de todo o animal, a cavidade gástrica com a solução de rifampicina a 50 μg / mL até que todos os detritos tenham sido expulso. A agulha não precisa necessariamente ser inserida na Hydra se o tamanho da Hydra não permitir. A agulha pode ser realizada perto da abertura da boca e apontada diretamente para a boca. </li><li> Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira a Hydra para um prato com 5081; g / mL de rifampicina em meio Hydra . </li></ol> 4. Controle de qualidade via imuno-histoquímica NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de protocolos por Shenk, M. A, et al. 18 , e Böttger, A 19 . Todas as etapas são feitas à temperatura ambiente (RT), a menos que seja indicado de outra forma. Um nutator pode ser usado para as etapas de incubação e pode melhorar a qualidade da coloração. No entanto, se o Hydra se enroscar um com o outro, todas as etapas também podem ser realizadas sem. <ol><li> Prepare a solução de bloqueio: 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de DMSO em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene esta solução a 4 ° C até o uso (passos 4.6 e 4.11). A solução pode ser armazenada por 1 a 2 dias. Nota: Todas as soluções utilizadas neste protocolo devem ser devidamente coletadas como resíduos perigosos. </li><li> Relaxe Hydra em 200 μL de 2% de uretano em Hydra mEdium durante 1 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Use 5 Hydra por tubo para cada uma das 4 condições: livre de nervo, não tratada, não tratada sem anticorpo primário e não tratada sem anticorpo secundário. Nota: Não exceda 1 min. O momento aqui é crítico, pois os animais estarão em mau estado depois de passarem muito tempo em uretano. </li><li> Remova o uretano e repare a Hidra em 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) no meio Hydra durante 15 min. </li><li> Lave as amostras 3 vezes com 1x PBS por 10 minutos cada. Nota: Todas as lavagens com PBS e PBSTx são feitas com 500 μL de solução. </li><li> Permeabilize com 500 μL de Triton X-100 a 0,5% em PBS durante 15 min. </li><li> Remova o Triton X-100 a 0,5% e adicione 500 μL da solução de bloqueio. Bloqueie as amostras por pelo menos 1 h. </li><li> Diluir o anticorpo anti-tirosina-tubulina 1: 200 em solução de bloqueio. Nota: Esta concentração foi deTerminou experimentalmente. Se o sinal nos controles for muito fraco, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. A pré-incubação do anticorpo também pode ajudar a reduzir a ligação não específica. </li><li> Remova a solução de bloqueio das amostras e adicione 200 μL do anticorpo primário à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum secundário. Para os controles não tratados com nenhum primário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo. </li><li> Incubar as amostras durante a noite (&gt; 12 h) a 4 ° C. Nota: Alternativamente, incubar 5 a 6 h à TA. </li><li> Remova o anticorpo primário e lave as amostras extensivamente com 0,3% de Triton X-100 em 1x PBS (PBSTx). Nota: Salve o anticorpo primário e armazene a 4 ° C, pois pode ser reutilizado pelo menos 2 a 3 vezes. </li><li> Diluir antibiótico secundário de cabra anti-mouse hPOdy 1: 500 em solução de bloqueio. Adicione 200 μL à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum primário. Para os controles não tratados com nenhum secundário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo. Nota: Alternativamente, um anticorpo secundário fluorescente pode ser usado, para o qual as etapas 4.13 - 4.17 não são necessárias. O uso de um secundário fluorescente economiza tempo e geralmente é adequado, mas o secundário hP fornece sensibilidade aumentada. A concentração do secundário foi determinada experimentalmente. Se os sinais nos controles forem muito fracos, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. </li><li> Incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova o anticorpo secundário e lave as amostras amplamente com PBSTx. </li><li> Prepare 1x PBT: 0,2% de albumina de soro bovino (peso / volume) e Tween20 a 0,05% em 1x PBS. Incube o sAmples em 1x PBT por 30 min. </li><li> Remova o 1x PBT e incuba as amostras em 1: 1000 NHS-fluoresceína e 1: 10 000 H 2 O 2 em 1x PBT durante 15 min no escuro. A partir desta etapa, mantenha as amostras no escuro, tanto quanto possível, à medida que o sinal fluorescente diminuirá quando estiverem expostos à luz. Nota: NHS-fluoresceína foi preparada seguindo um protocolo FISH detalhado por King, RS e Newmark, PA 20 </li><li> Lave as amostras 3 vezes com PBSTx rapidamente, então 2 vezes por 30 min. </li><li> Deixe as amostras em PBSTx durante a noite a 4 ° C para continuar lavando. </li><li> Faça mais algumas lavagens com 1x PBSTx. Para visualizar núcleos celulares, execute as seguintes etapas opcionais para contra-coloração de DNA usando dicloridrato de 4 &#39;, 6-diamindino-2-fenilindol, (DAPI). Caso contrário, as amostras podem ser visualizadas agora. </li><li> Diluir 5 mg / mL de DAPI para uma concentração de trabalho de 1: 500 em PBSTx e adicionar 200 μL a cada tubo. IncuBate as amostras por 30 min. Cuidado: DAPI é um carcinógeno conhecido. Use PPE completo. </li><li> Remova o DAPI e lave as amostras 2 a 3 vezes com PBSTx antes da imagem com microscopia de fluorescência. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

As células intersticiais da Hydra podem ser eliminadas através de um tratamento com colchicina dupla 3 , 4 . Nos dias que se seguem ao primeiro tratamento, é fundamental evitar o contato entre Hydra individual para evitar a fusão de peças Hydra em Hydra deformada. Além disso, os animais que podem comer sem assistência após o primeiro tratamento devem ser removidos, pois o segundo tratamento com colchicina pode...

O sistema nervoso de Hydra consiste em uma rede nervosa, com neurônios associados a ambas as camadas de tecido epitelial 1 . A rede nervosa é mais densa no hipossênero e pedúnculo e menos densa na coluna 2 do corpo. As células nervosas são originárias de células estaminais intersticiais, que são células-tronco multipotentes que originam células secretoras, nematócitos, células germinativas e neurônios 1 . É possível eliminar as células intersticiais de Hydra vulgaris através do tratamento com colchicina 3 , 4 , uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão. Embora a colicicina tenha inibido a polimerização de microtúbulos em outros organismos, um estudo anterior mostrou que os microtúbulos estão presentes na Hydra ao longo de todo o tratamento, sugerindo que a colchicina não age dessa maneira na Hydra 3 . Outra stSugere que a colchicina não se liga de forma eficiente à tubulina em alguns organismos, incluindo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, o que pode explicar essa diferença 5 . O tratamento com colchicina induz a fagocitose das células intersticiais pelas células epiteliais endodérmicas 3 e, portanto, permite a criação de animais que faltam células nervosas, células da glândula e nematócitos. Não está claro por que as células intersticiais são particularmente suscetíveis ao tratamento com colchicina. Dado que as células intersticiais pós-mitóticas e a linhagem das células estaminais intersticiais são danificadas e fagocitadas, Campbell concluiu que a colicicina não afetou diretamente a atividade mitótica 3 . Notavelmente, o tratamento com colchicina funciona bem em Hydra vulgaris, mas foi demonstrado que não funciona também em outras espécies, como Hydra oligactis 6 . </Em&gt; Um tratamento modificado com colchicina e hidroxiureia pode ser usado para produzir Hydra viridis livre de nervos 7 . A hidra sem nervos (também às vezes referida como &quot; Hydra epitelial&quot; 8 ) é, portanto, uma ferramenta útil para estudar os papéis desses tipos de células especializadas a partir da linhagem celular intersticial na homeostase e regeneração do tecido. Hydra pode ser o único exemplo conhecido de um animal capaz de viver sem um sistema nervoso. Hydra sem nervos serve como um modelo particularmente útil para dissecar o papel da rede nervosa na regulação da regeneração, homeostase e comportamento da Hydra . Por exemplo, a introdução de células intersticiais na hidra livre de nervos através do enxerto permitiu a caracterização da diferenciação de células nervosas como altamente específico da região 9 . Além disso, uma vez que Hydra livre de nervos pode se regenerar, elesPermitir a investigação de caminhos de regeneração independentes do sistema nervoso. Um desses exemplos é a neurogênese apical e a formação da cabeça, que demonstrou depender da função cnox-2 no sistema nervoso em Hydra de tipo selvagem, mas parece ser dispensável na hidra livre de nervos, sugerindo que pode haver um processo alternativo de regeneração da cabeça 10 . A hidra sem nervos também tem sido utilizada para estudar a expressão das células epiteliais e a regulação de genes neurogênicos e de neurotransmissão após a perda de neurogênese 11 . A hidra sem nervos não exibe rajadas de contração espontâneas 12 , indicando que essas explosões são reguladas pelo sistema nervoso. Hydra do Nerve-free, no entanto, contrata em resposta a beliscar a coluna do corpo com fórceps, sugerindo que a contração em resposta a estímulos mecânicos é mediada por acoplamento através deJunções gap gh nas células epiteliais, enquanto o comportamento contrátil espontâneo é mediado pelo acoplamento através de junções gap nas células nervosas 13 . A hidra sem nervos não abre a boca quando é apresentada com alimentos ou glutationa reduzida 3 , sugerindo que os neurônios sensoriais são necessários para detectar a presença de alimentos e sinalizar a boca para abrir. Além disso, a rede nervosa parece desempenhar um papel na detecção da pressão osmótica, porque os animais sem nervos são incapazes de regular de forma autônoma sua pressão hidrostática interna através da abertura da boca, causando a aparência característica do balão 3 , 4 ( Figura 1B ). O regulamento da pressão hidrostática na hidra livre de nervos por deflação manual freqüente levou à perda de alguma morfologia anormal na coluna de hipossetro e corpo. No entanto, a deflação crônica levou à interferência com o crescimento,Organização de articulação, brotação e tecido 8 . Embora a hidra não livre de nervos seja incapaz de alimentar e, por exemplo, sozinha, é possível mantê-los indefinidamente no laboratório manualmente forçando e erguendo cada animal. Publicações anteriores descreveram métodos de alimentação forçada e eructação de Hydra sem nervos, no entanto, esses protocolos envolveram o uso de dicas de micropipetas que devem ser puxadas manualmente para o tamanho apropriado, bem como o uso de um bocal conectado à pipeta pela tubulação 14 . Aqui, é descrito um método de alimentação e burping mais simples, seguro e com maior tempo. Além disso, estudos anteriores envolveram verificar a ausência de células nervosas através da dissociação de animais fixos em células individuais e exame de morfologia celular 3 , 4 , 15 . HAntes, foi utilizada a imuno-histoquímica com um anticorpo monoclonal contra o terminal carboxilo tirosinado da alfa-tubulina como método complementar para maceração para verificar a depleção de neurônios no hiposstoma 13,16. Estudos anteriores mostraram que os neurônios no pedúnculo também podem ser visualizados usando este anticorpo 13 , no entanto, esses neurônios, bem como aqueles na coluna do corpo, são mais difíceis de distinguir. Embora a imuno-histoquímica seja suficiente para confirmar a ausência de células nervosas no hiposstoma e não requer experiência em morfologia do tipo celular, não pode ser usado para verificar a ausência das células estaminais intersticiais e os outros derivados dessas células. Os estudos de dissociação e morfologia celular são mais rigorosos e podem fornecer uma contagem quantitativa dos números de cada tipo de célula que permanece após cada etapa do tratamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">Colchicine</td>
			<td style="width:75px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">227120010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:75px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">301025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Eggs</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased locally</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Brine Shrimp Hatchery Dish</td>
			<td style="width:75px;">Brine Shrimp Direct</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 mm x 15 mm Petri Dish</td>
			<td style="width:75px;">Celltreat</td>
			<td style="width:119px;">229663</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">30 G x 3/4&#34; Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:75px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">1188830340</td>
			<td style="width:167px;">A 27G needle may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 x Fine-tip Tweezers</td>
			<td style="width:75px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:75px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">557303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td>
			<td style="width:75px;">Enzo</td>
			<td style="width:119px;">ADI-SAB-100-J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9703-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td style="width:75px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-920A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10437028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Tablets</td>
			<td style="width:75px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">2810305</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X - 100</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Urethane</td>
			<td style="width:75px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Air Pump</td>
			<td style="width:75px;">Tetra</td>
			<td style="width:119px;">77846-00</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-916</td>
			<td style="width:167px;">Length of the pipet does not matter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml Tube</td>
			<td style="width:75px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-670</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">P320 Sandpaper</td>
			<td style="width:75px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">IBGABBV00397</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased at local home improvement store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

A linhagem celular intersticial de Hydra inclui células estaminais multipotentes e seus derivados: células da glândula, nematócitos, células germinativas e células nervosas. As células intersticiais podem ser eliminadas através de dois tratamentos consecutivos com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão, eliminando o potencial de renovação das células diferenciadas derivadas das células estaminais intersticiais. Isso permite a geração de Hydra que carece de células nervosas. Um pólipo livre de nervos não pode abrir a boca para alimentar, por exemplo, ou regular a pressão osmótica. Tais animais, no entanto, podem sobreviver e ser cultivados indefinidamente no laboratório, se regularmente forçados e erguidos. A falta de células nervosas permite estudos sobre o papel do sistema nervoso na regulação do comportamento e regeneração dos animais. Os protocolos previamente publicados para a manutenção da Hydra sem nervos envolvem técnicas desatualizadas, como a pipetagem bucal com micropipetas tIps para alimentar e limpar a Hydra . Aqui, é introduzido um protocolo melhorado para a manutenção da hidra livre de nervos. As pinças de ponta fina são usadas para forçar a abertura da boca e inserir Artemia recentemente matada. Após a alimentação forçada, a cavidade do corpo do animal é lavada com meio fresco usando uma seringa e uma agulha hipodérmica para remover material não digerido, aqui referido como &quot;eructo&quot;. Este novo método de alimentação forçada e eructação de hidratação livre de nervos através do uso de fórceps e seringas elimina a necessidade de pipetagem bucal usando pontas de micropipetas extraídas à mão. Isso torna o processo mais seguro e significativamente mais eficiente no tempo. Para garantir que as células nervosas no hipossêtomo tenham sido eliminadas, é realizada a imuno-histoquímica utilizando tirosina-tubulina.

Imediatamente após o tratamento inicial de 8 h de colchicina, todos os Hydra sobrevivem. Algumas dessas Hydra terão apenas os talões do tentáculo restantes ( Figura 3 A ), enquanto outros terão perdido completamente seus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante os seguintes 1 ou 2 dias, os tentáculos continuarão a diminuir até que todas as Hydra tenham perdido seus ...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.4K visualizações.  UC San Diego.  Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório. 

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...