Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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Os autores agradecem ao Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por discussões sobre o protocolo original para gerar e manter animais sem nervos, a Sra. Rui Wang para ajudar a adaptar a seringa e a técnica da agulha, e a Sra. Danielle Hagstrom e o Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão RCSA e NSF CMMI-1463572.

1. Tratamento duplo de colchicina <ol><li> Faça uma solução de 0,4% de colchicina (peso / volume) em Hydra medium 3 , 4 , 17 . Cuidado: Colchicina é extremamente tóxica, fatal se ingerido, pode causar defeitos genéticos e pode causar danos nos olhos. Pegue o pó em uma chaminé e use equipamentos de proteção pessoal completos (PPE). </li><li> Incubar Hydra vulgaris (estirpe AEP aqui utilizada) que foram submetidos à privação durante 24 horas em 0,4% de colchicina na proporção de 5 Hydra por mL de solução de colchicina em uma placa de Petri durante 8 h à temperatura ambiente no escuro. Nota: 5 Hydra / mL colchicina é uma diretriz para determinar a quantidade de solução a ser utilizada para evitar o superlotação do prato com Hydra . Use o mesmo volume de solução para limitações subsequentes e mudanças na solução. </li><li> Remova a solução de colchicina e substituaCom meio de hidra limpo sem colchicina. Lave o Hydra 5 vezes por transferência serial com uma pipeta Pasteur de vidro para limpar o meio de Hydra antes de transferir para 50 μg / mL de rifampicina no meio de Hydra . Mantenha a Hidra em uma incubadora a 18 ° C. Nota: Pode ser armazenada uma quantidade suficiente de 1000 x rifampicina (50 mg / mL) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) durante 1-2 semanas de tratamento a 4 ° C. A quantidade exata pode ser determinada pelo volume total de solução utilizada a cada dia. Por exemplo, se houver 2 pratos, cada um contendo 10 mL de solução que precisa ser alterado duas vezes por dia, um total de 40 mL de solução será usado em um dia, correspondendo a 40 μL de estoque de 1000X por dia ou 560 μL Durante um período de duas semanas. O estoque é então diluído 1: 1000 em meio Hydra após o uso. Cuidado: O DMSO é um líquido combustível e penetra prontamente na pele, permitindo outros produtos químicos dissolvidos no corpo. MãoDeixe o solvente em uma exaustão e use PPE cheio. De notar, o DMSO congela a 4 ° C </li><li> Mude o meio de Hydra contendo rifampicina duas vezes por dia até o Hydra parar de expulsar as células para o meio, o que é geralmente por 1 semana após o tratamento. Neste ponto, o meio pode ser alterado uma vez por dia. Durante os dias que seguem o tratamento, a Hydra perderá completamente seus tentáculos. Evite que o Hydra entre em contato, uma vez que eles podem fundir-se e resultar em Hydra de forma estranha ( Figura 2 A ). <ol><li> Para evitar contato, evite rodar o prato em movimento circular. Em vez disso, agite suavemente o prato nas direções vertical e horizontal até o Hydra se espalhar. Inspecione o prato ao colocar a Hidra na incubadora a 18 ° C e ajuste conforme necessário. Observação: para os dias em que o meio é alterado duas vezes, mude o meioUma vez de manhã e novamente à tarde / à noite. </li></ol></li><li> Uma vez que os tentáculos começam a se formar, comece a forçar e eructar o Hydra 3 a 4 vezes por semana (ver Seções 2 e 3). Cerca de 8-9 dias após o tratamento com colchicina, o Hydra começará a desenvolver seus tentáculos de volta. Nota: O crescimento do tentáculo varia entre os indivíduos. Alguns podem demorar mais de 8 a 9 dias antes de mostrar sinais de crescimento do tentáculo. Aqueles que não regeneram seus tentáculos, bem como animais estranhos ( Figura 2 B ) ou animais muito pequenos para serem alimentados devem ser removidos. Esses Hydra provavelmente não sobreviverão ao segundo tratamento. A Hydra também pode brotar. No entanto, alguns dos botões podem ainda ter células intersticiais e poder comer por conta própria. <ol><li> Remova quaisquer botões que possam comer sem assistência e se separar do animal pai. Identifique esses animais adicionando Artemia ao vivo aoAlimentando o prato e observando se os animais pegarão e comerão o Artemia por conta própria. 1 ou 2 Hydra também podem comer por conta própria. Estes também devem ser descartados. Nota: A hidra sem nervos possui uma característica morfologia semelhante a um balão e tentáculos mais curtos e mais finos do que o normal (devido à perda de nematócitos) e, portanto, podem ser facilmente distinguidos dos animais com aparência normal ( Figura 1 A, 1B ). </li></ol></li><li> Três semanas após o primeiro tratamento com colchicina, repita o tratamento com colchicina (passos 1.1 - 1.5). Um segundo tratamento com colchicina é necessário para eliminar as células intersticiais remanescentes e as células nervosas 3 . </li></ol> 2. Força-Alimentação <ol><li> Adicione os cistos de Artemia a um recipiente de vidro estreito e alto que se afunde no fundo. Encha o recipiente com água de Artemia (NaCl 6,72 M). Evite exceCom 1 g de cistos por 1 L de água para um maior rendimento da escotilha. <ol><li> Cubra a parte superior do recipiente com parafilme e insira uma pipeta sorológica de 10 mL através do parafilme no recipiente. Forneça a aeração conectando tubos a uma bomba de ar do aquário e encaixando a tubulação em torno da pipeta. Certifique-se de que a ponta da pipeta alcance a parte inferior do recipiente e que nenhum cisto esteja instalado na parte inferior. O Artemia irá escotilhar depois das 48 h. Nota: Existem muitas maneiras diferentes de criar Artemia que pode funcionar tão bem. </li></ol></li><li> Coloque o Artemia da água Artemia em uma rede Artemia (disponível nas empresas de abastecimento de aquários) e lave-os por cerca de 20 s em água DI antes de colocá-los em um prato com meio Hydra . A salinidade da água de Artemia é muito alta para Hydra , então o Artemia deve ser lavado antes de serem usados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação,Euthanize o Artemia apertando-os ligeiramente com um par de pinças finas. Evite espremer com força o suficiente para expulsar as tripas, pois isso irá manter a pinça e dificultar a alimentação. Apertar ligeiramente o Artemia antes de alimentá-lo ao Hydra ajudará no processo de digestão 14 . Coloque o Artemia recentemente morto perto da Hidra no prato para facilitar a alimentação rápida. Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Use um par de pinças para segurar a Hydra pelo pedúnculo. Continue segurando o pedúnculo durante o processo de alimentação da Hydra . Usando um segundo par de fórceps, pitada a coluna do corpo para fazer o contrato Hydra . </li><li> Enquanto segura as pontas do segundo par de fórceps juntos, toque no centro do hipossetro (a estrutura em forma de abóbada na extremidade oral do animal). Isso, por vezes, faz com que a boca se abra. EuF a boca não abre batendo, perfure a boca, inserindo a pinça no centro do hipossetro e depois solte levemente a pressão nas pontas da pinça. Isso deve esticar a abertura da boca feita pela punção. Nota: O Hydra pode desinflar e desabar quando a boca é aberta ( Figura 2 C ). Se isso ocorrer, o Artemia ainda pode ser inserido no Hydra . Se é muito difícil fazê-lo, avance para o próximo Hydra e volte ao Hydra original um pouco mais tarde e tente novamente. A Hydra tende a não se esvaziar tanto durante as aberturas de boca subseqüentes. </li><li> Pegue rapidamente Artemia com a pinça e insira-os na cavidade gástrica da Hydra . Insira o máximo de Artemia possível até a cavidade gástrica estar cheia e mais Artemia não pode ser inserida sem danificar a Hidra , acidenteAliado retirando qualquer Artemia para dentro, ou impedindo que a boca se feche. Em média, isso é de 5 a 6 Artemia , no entanto, até 12 foram alimentados aos animais maiores. <ol><li> Se a boca começar a fechar, estique-se novamente com a pinça conforme descrito acima; No entanto, deve ser tomado cuidado, pois qualquer Artemia já dentro do animal pode começar a sair quando a boca é reaberta. </li><li> Se a Hydra é muito pequena para um Artemia inteiro, corte o Artemia usando um bisturi e alimente as peças menores da Hydra . Se o Artemia não ficar dentro da Hidra , pode ser necessário pressionar a pinça contra o Artemia para mantê-lo dentro da Hidra até sua boca se fechar. </li></ol></li><li> Transferir a Hydra alimentada com uma pipeta Pasteur de vidro, cuidadosamente para evitar eructos acidentais, em um prato com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra . Se um Artemia foi expulso fRom a Hydra enquanto se transfere, reinsira-a enquanto estiver no novo prato. Nota: Uma pipeta de vidro é usada para transferir a Hydra , pois descobriu que a Hydra se encaixou menos no vidro em comparação com o plástico. O comprimento da pipeta não importa, mas usar pipetas de 5 polegadas pode ser um pouco mais fácil. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Burp Hydra para remover material não digerido a qualquer momento entre 8 e 20 h após a alimentação. </li><li> Areia no ponto de uma agulha hipodérmica 30G com P320 ou papel de lixa de grão semelhante até a ponta ser plana. Nota: Uma agulha hipodérmica 27G também funcionaria, mas a ponta menor do calibre mais alto é preferível. </li><li> Anexe a agulha a uma seringa de plástico descartable de 1 mL e encha a seringa com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra . Nota: Burping One Hydra leva cerca de 0,05 mL a 0,1 mL de solução. Um syri de 1 mLNge é preferível, uma vez que o controle da força e do volume da solução que sai é mais difícil com uma seringa de volume maior. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, segure o pedúnculo da Hidra com fórceps finos e toque no centro do hipossetro com a agulha. Se a boca não abrir, insira fórceps no hiposstoma e abra a boca como descrito acima para alimentação. Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Use a seringa para nivelar, muito gentilmente, para evitar o afundamento de todo o animal, a cavidade gástrica com a solução de rifampicina a 50 μg / mL até que todos os detritos tenham sido expulso. A agulha não precisa necessariamente ser inserida na Hydra se o tamanho da Hydra não permitir. A agulha pode ser realizada perto da abertura da boca e apontada diretamente para a boca. </li><li> Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira a Hydra para um prato com 5081; g / mL de rifampicina em meio Hydra . </li></ol> 4. Controle de qualidade via imuno-histoquímica NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de protocolos por Shenk, M. A, et al. 18 , e Böttger, A 19 . Todas as etapas são feitas à temperatura ambiente (RT), a menos que seja indicado de outra forma. Um nutator pode ser usado para as etapas de incubação e pode melhorar a qualidade da coloração. No entanto, se o Hydra se enroscar um com o outro, todas as etapas também podem ser realizadas sem. <ol><li> Prepare a solução de bloqueio: 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de DMSO em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene esta solução a 4 ° C até o uso (passos 4.6 e 4.11). A solução pode ser armazenada por 1 a 2 dias. Nota: Todas as soluções utilizadas neste protocolo devem ser devidamente coletadas como resíduos perigosos. </li><li> Relaxe Hydra em 200 μL de 2% de uretano em Hydra mEdium durante 1 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Use 5 Hydra por tubo para cada uma das 4 condições: livre de nervo, não tratada, não tratada sem anticorpo primário e não tratada sem anticorpo secundário. Nota: Não exceda 1 min. O momento aqui é crítico, pois os animais estarão em mau estado depois de passarem muito tempo em uretano. </li><li> Remova o uretano e repare a Hidra em 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) no meio Hydra durante 15 min. </li><li> Lave as amostras 3 vezes com 1x PBS por 10 minutos cada. Nota: Todas as lavagens com PBS e PBSTx são feitas com 500 μL de solução. </li><li> Permeabilize com 500 μL de Triton X-100 a 0,5% em PBS durante 15 min. </li><li> Remova o Triton X-100 a 0,5% e adicione 500 μL da solução de bloqueio. Bloqueie as amostras por pelo menos 1 h. </li><li> Diluir o anticorpo anti-tirosina-tubulina 1: 200 em solução de bloqueio. Nota: Esta concentração foi deTerminou experimentalmente. Se o sinal nos controles for muito fraco, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. A pré-incubação do anticorpo também pode ajudar a reduzir a ligação não específica. </li><li> Remova a solução de bloqueio das amostras e adicione 200 μL do anticorpo primário à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum secundário. Para os controles não tratados com nenhum primário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo. </li><li> Incubar as amostras durante a noite (&gt; 12 h) a 4 ° C. Nota: Alternativamente, incubar 5 a 6 h à TA. </li><li> Remova o anticorpo primário e lave as amostras extensivamente com 0,3% de Triton X-100 em 1x PBS (PBSTx). Nota: Salve o anticorpo primário e armazene a 4 ° C, pois pode ser reutilizado pelo menos 2 a 3 vezes. </li><li> Diluir antibiótico secundário de cabra anti-mouse hPOdy 1: 500 em solução de bloqueio. Adicione 200 μL à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum primário. Para os controles não tratados com nenhum secundário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo. Nota: Alternativamente, um anticorpo secundário fluorescente pode ser usado, para o qual as etapas 4.13 - 4.17 não são necessárias. O uso de um secundário fluorescente economiza tempo e geralmente é adequado, mas o secundário hP fornece sensibilidade aumentada. A concentração do secundário foi determinada experimentalmente. Se os sinais nos controles forem muito fracos, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. </li><li> Incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova o anticorpo secundário e lave as amostras amplamente com PBSTx. </li><li> Prepare 1x PBT: 0,2% de albumina de soro bovino (peso / volume) e Tween20 a 0,05% em 1x PBS. Incube o sAmples em 1x PBT por 30 min. </li><li> Remova o 1x PBT e incuba as amostras em 1: 1000 NHS-fluoresceína e 1: 10 000 H 2 O 2 em 1x PBT durante 15 min no escuro. A partir desta etapa, mantenha as amostras no escuro, tanto quanto possível, à medida que o sinal fluorescente diminuirá quando estiverem expostos à luz. Nota: NHS-fluoresceína foi preparada seguindo um protocolo FISH detalhado por King, RS e Newmark, PA 20 </li><li> Lave as amostras 3 vezes com PBSTx rapidamente, então 2 vezes por 30 min. </li><li> Deixe as amostras em PBSTx durante a noite a 4 ° C para continuar lavando. </li><li> Faça mais algumas lavagens com 1x PBSTx. Para visualizar núcleos celulares, execute as seguintes etapas opcionais para contra-coloração de DNA usando dicloridrato de 4 &#39;, 6-diamindino-2-fenilindol, (DAPI). Caso contrário, as amostras podem ser visualizadas agora. </li><li> Diluir 5 mg / mL de DAPI para uma concentração de trabalho de 1: 500 em PBSTx e adicionar 200 μL a cada tubo. IncuBate as amostras por 30 min. Cuidado: DAPI é um carcinógeno conhecido. Use PPE completo. </li><li> Remova o DAPI e lave as amostras 2 a 3 vezes com PBSTx antes da imagem com microscopia de fluorescência. </li></ol>

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	<li>Bode, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+cell+lineage+of+Hydra:+a+stem+cell+system+that+arose+early+in+evolution.">The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution.</a> J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).</li><li>Hager, G., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+differentiated+nerve+cells+in+hydra+is+determined+by+precursor+migration.">Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration.</a> Development. 124, 569-576 (1997).</li><li>Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+Hydra+interstitial+and+nerve+cells+by+means+of+colchicine.">Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine.</a> J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).</li><li>Marcum, B. A., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Hydra+lacking+nerve+and+interstitial+cells.">Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells.</a> J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).</li><li>Burns, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H-colchicine+binding:+Failure+to+detect+any+binding+to+soluble+proteins+from+various+lower+organisms.">3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms.</a> Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).</li><li>Lee, H. -. T., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Behavior+of+an+Intergeneric+Chimera+of+Hydra+(Pelmatohydra+oligactis+Interstitial+Cells+Hydra+attenuata+Epithelial+Cells).">Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells).</a> Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).</li><li>Novak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Hydra+viridis+with+Nerve+Cells+and+No+Interstitial+Cells,+or+with+Neither+of+These+Cell+Types.">Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types.</a> Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).</li><li>Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hydrostatic+pressure+on+morphogenesis+in+nerve-free+Hydra.">Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra.</a> J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).</li><li>Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+cell+differentiation+in+nerve-free+tissue+of+epithelial+Hydra+from+precursor+cells+introduced+by+grafting.">Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting.</a> Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).</li><li>Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+regeneration+in+wild-type+hydra+requires+de+novo+neurogenesis.">Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis.</a> Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).</li><li>Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+neurogenesis+in+Hydra+leads+to+compensatory+regulation+of+neurogenic+and+neurotransmission+genes+in+epithelial+cells.">Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).</li><li>Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+of+nerve-free+Hydra.">Excitability of nerve-free Hydra.</a> Nature. 262, 388-390 (1976).</li><li>Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innexin+gap+junctions+in+nerve+cells+coordinate+spontaneous+contractile+behavior+in+Hydra+polyps.">Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps.</a> Sci. Rep. 4 (3573), (2014).</li><li>Marcum, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Epithelial+Hydra.">Culturing Epithelial Hydra.</a> Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+maceration+of+Hydra+tissue.">A quantitative method for maceration of Hydra tissue.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).</li><li>Gr&#246;ger, H., Schmid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+development+in+Cnidaria:+A+connection+to+Bilateria.">Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria.</a> Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).</li><li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water,+Culture+Solutions,+and+Buffers.">Water, Culture Solutions, and Buffers.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cnox-2,+a+HOM/HOX+homeobox+gene+in+hydra,+is+correlated+with+axial+pattern+formation.">Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation.</a> Development. 117, 657-667 (1993).</li><li>B&#246;ttger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Gene+Transfer+Contributed+to+the+Evolution+of+Extracellular+Surface+Structures:+The+Freshwater+Polyp+Hydra+Is+Covered+by+a+Complex+Fibrous+Cuticle+Containing+Glycosaminoglycans+and+Proteins+of+the+PPOD+and+SWT+(Sweet+Tooth)+Families.">Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families.</a> PLoS One. 7 (12), (2012).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As células intersticiais da Hydra podem ser eliminadas através de um tratamento com colchicina dupla 3 , 4 . Nos dias que se seguem ao primeiro tratamento, é fundamental evitar o contato entre Hydra individual para evitar a fusão de peças Hydra em Hydra deformada. Além disso, os animais que podem comer sem assistência após o primeiro tratamento devem ser removidos, pois o segundo tratamento com colchicina pode...

O sistema nervoso de Hydra consiste em uma rede nervosa, com neurônios associados a ambas as camadas de tecido epitelial 1 . A rede nervosa é mais densa no hipossênero e pedúnculo e menos densa na coluna 2 do corpo. As células nervosas são originárias de células estaminais intersticiais, que são células-tronco multipotentes que originam células secretoras, nematócitos, células germinativas e neurônios 1 . É possível eliminar as células intersticiais de Hydra vulgaris através do tratamento com colchicina 3 , 4 , uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão. Embora a colicicina tenha inibido a polimerização de microtúbulos em outros organismos, um estudo anterior mostrou que os microtúbulos estão presentes na Hydra ao longo de todo o tratamento, sugerindo que a colchicina não age dessa maneira na Hydra 3 . Outra stSugere que a colchicina não se liga de forma eficiente à tubulina em alguns organismos, incluindo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, o que pode explicar essa diferença 5 . O tratamento com colchicina induz a fagocitose das células intersticiais pelas células epiteliais endodérmicas 3 e, portanto, permite a criação de animais que faltam células nervosas, células da glândula e nematócitos. Não está claro por que as células intersticiais são particularmente suscetíveis ao tratamento com colchicina. Dado que as células intersticiais pós-mitóticas e a linhagem das células estaminais intersticiais são danificadas e fagocitadas, Campbell concluiu que a colicicina não afetou diretamente a atividade mitótica 3 . Notavelmente, o tratamento com colchicina funciona bem em Hydra vulgaris, mas foi demonstrado que não funciona também em outras espécies, como Hydra oligactis 6 . </Em&gt; Um tratamento modificado com colchicina e hidroxiureia pode ser usado para produzir Hydra viridis livre de nervos 7 . A hidra sem nervos (também às vezes referida como &quot; Hydra epitelial&quot; 8 ) é, portanto, uma ferramenta útil para estudar os papéis desses tipos de células especializadas a partir da linhagem celular intersticial na homeostase e regeneração do tecido. Hydra pode ser o único exemplo conhecido de um animal capaz de viver sem um sistema nervoso. Hydra sem nervos serve como um modelo particularmente útil para dissecar o papel da rede nervosa na regulação da regeneração, homeostase e comportamento da Hydra . Por exemplo, a introdução de células intersticiais na hidra livre de nervos através do enxerto permitiu a caracterização da diferenciação de células nervosas como altamente específico da região 9 . Além disso, uma vez que Hydra livre de nervos pode se regenerar, elesPermitir a investigação de caminhos de regeneração independentes do sistema nervoso. Um desses exemplos é a neurogênese apical e a formação da cabeça, que demonstrou depender da função cnox-2 no sistema nervoso em Hydra de tipo selvagem, mas parece ser dispensável na hidra livre de nervos, sugerindo que pode haver um processo alternativo de regeneração da cabeça 10 . A hidra sem nervos também tem sido utilizada para estudar a expressão das células epiteliais e a regulação de genes neurogênicos e de neurotransmissão após a perda de neurogênese 11 . A hidra sem nervos não exibe rajadas de contração espontâneas 12 , indicando que essas explosões são reguladas pelo sistema nervoso. Hydra do Nerve-free, no entanto, contrata em resposta a beliscar a coluna do corpo com fórceps, sugerindo que a contração em resposta a estímulos mecânicos é mediada por acoplamento através deJunções gap gh nas células epiteliais, enquanto o comportamento contrátil espontâneo é mediado pelo acoplamento através de junções gap nas células nervosas 13 . A hidra sem nervos não abre a boca quando é apresentada com alimentos ou glutationa reduzida 3 , sugerindo que os neurônios sensoriais são necessários para detectar a presença de alimentos e sinalizar a boca para abrir. Além disso, a rede nervosa parece desempenhar um papel na detecção da pressão osmótica, porque os animais sem nervos são incapazes de regular de forma autônoma sua pressão hidrostática interna através da abertura da boca, causando a aparência característica do balão 3 , 4 ( Figura 1B ). O regulamento da pressão hidrostática na hidra livre de nervos por deflação manual freqüente levou à perda de alguma morfologia anormal na coluna de hipossetro e corpo. No entanto, a deflação crônica levou à interferência com o crescimento,Organização de articulação, brotação e tecido 8 . Embora a hidra não livre de nervos seja incapaz de alimentar e, por exemplo, sozinha, é possível mantê-los indefinidamente no laboratório manualmente forçando e erguendo cada animal. Publicações anteriores descreveram métodos de alimentação forçada e eructação de Hydra sem nervos, no entanto, esses protocolos envolveram o uso de dicas de micropipetas que devem ser puxadas manualmente para o tamanho apropriado, bem como o uso de um bocal conectado à pipeta pela tubulação 14 . Aqui, é descrito um método de alimentação e burping mais simples, seguro e com maior tempo. Além disso, estudos anteriores envolveram verificar a ausência de células nervosas através da dissociação de animais fixos em células individuais e exame de morfologia celular 3 , 4 , 15 . HAntes, foi utilizada a imuno-histoquímica com um anticorpo monoclonal contra o terminal carboxilo tirosinado da alfa-tubulina como método complementar para maceração para verificar a depleção de neurônios no hiposstoma 13,16. Estudos anteriores mostraram que os neurônios no pedúnculo também podem ser visualizados usando este anticorpo 13 , no entanto, esses neurônios, bem como aqueles na coluna do corpo, são mais difíceis de distinguir. Embora a imuno-histoquímica seja suficiente para confirmar a ausência de células nervosas no hiposstoma e não requer experiência em morfologia do tipo celular, não pode ser usado para verificar a ausência das células estaminais intersticiais e os outros derivados dessas células. Os estudos de dissociação e morfologia celular são mais rigorosos e podem fornecer uma contagem quantitativa dos números de cada tipo de célula que permanece após cada etapa do tratamento.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

A linhagem celular intersticial de Hydra inclui células estaminais multipotentes e seus derivados: células da glândula, nematócitos, células germinativas e células nervosas. As células intersticiais podem ser eliminadas através de dois tratamentos consecutivos com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão, eliminando o potencial de renovação das células diferenciadas derivadas das células estaminais intersticiais. Isso permite a geração de Hydra que carece de células nervosas. Um pólipo livre de nervos não pode abrir a boca para alimentar, por exemplo, ou regular a pressão osmótica. Tais animais, no entanto, podem sobreviver e ser cultivados indefinidamente no laboratório, se regularmente forçados e erguidos. A falta de células nervosas permite estudos sobre o papel do sistema nervoso na regulação do comportamento e regeneração dos animais. Os protocolos previamente publicados para a manutenção da Hydra sem nervos envolvem técnicas desatualizadas, como a pipetagem bucal com micropipetas tIps para alimentar e limpar a Hydra . Aqui, é introduzido um protocolo melhorado para a manutenção da hidra livre de nervos. As pinças de ponta fina são usadas para forçar a abertura da boca e inserir Artemia recentemente matada. Após a alimentação forçada, a cavidade do corpo do animal é lavada com meio fresco usando uma seringa e uma agulha hipodérmica para remover material não digerido, aqui referido como &quot;eructo&quot;. Este novo método de alimentação forçada e eructação de hidratação livre de nervos através do uso de fórceps e seringas elimina a necessidade de pipetagem bucal usando pontas de micropipetas extraídas à mão. Isso torna o processo mais seguro e significativamente mais eficiente no tempo. Para garantir que as células nervosas no hipossêtomo tenham sido eliminadas, é realizada a imuno-histoquímica utilizando tirosina-tubulina.

Imediatamente após o tratamento inicial de 8 h de colchicina, todos os Hydra sobrevivem. Algumas dessas Hydra terão apenas os talões do tentáculo restantes ( Figura 3 A ), enquanto outros terão perdido completamente seus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante os seguintes 1 ou 2 dias, os tentáculos continuarão a diminuir até que todas as Hydra tenham perdido seus ...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.5K visualizações.  UC San Diego.  Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório. 

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Biologia do Desenvolvimento

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Neurociência

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Bioengenharia

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Hibridização In Situ fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofecção eficiente de NSCs isoladas da zona subventricular murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Nucleofecção aprimorada para entrega de genes de alta eficiência em culturas de células-tronco neurais derivadas da zona subventricular murina</

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free

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