Este trabajo fue apoyado por la Christopher y Dana Reeve Foundation internacional Consorcio de investigación en lesión de la médula espinal, el Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fundación de JPB, el Instituto Novartis de investigación básica, generosas contribuciones de Vicente y Stella Coates y Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Todos los procedimientos que involucran a roedores conforman a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplan con las políticas y las leyes estatales y nacionales. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de la Universidad de Stanford sobre cuidado de animales de laboratorio.
Nota: Todas las composiciones solución y buffer son proporcionadas en la Tabla de materiales.
1. prepare una placa de Petri Immunopanning de CD11b (día 0)
Nota: Preparar 1 immunopanning plato de cada cerebro de rata juvenil 1-2.
<ol><li>Añadir 25 mL de 50 mM solución de Tris pH 9.5 a un plato de Petri de 15 cm.</li>
	<li>Añadir cabra anti-ratón IgG (cadenas H + L) en el plato para una concentración final de 6 μg/mL. Remolino de placa para distribuir uniformemente.</li>
	<li>Incubar el plato para 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Platos de enjuague tres veces con DPBS++ (tampón fosfato salino (PBS) con Ca2 + y Mg2 +), reemplácelo con una solución de lavado tampón que contiene 1 μg/mL de anticuerpos OX42. Deje los platos durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana.</li>
</ol>2. tejido colección (día 1)
Nota: Este protocolo debe tomar ~ 3-4 h.
<ol><li>Antes de empezar, asegúrese de que todas las soluciones son estériles y refrigeradas con hielo. Enfriar todos los instrumentos en el hielo y esterilizar con etanol antes de usarlo.</li>
	<li>Siguientes procedimientos regulatorios apropiados, sacrificar a una rata de laboratorio juvenil por asfixia dióxido de carbono. Nota: Como alternativa, animales más jóvenes que sean sacrificados con una dosis letal de ketamina/xilacina (100-200 μL de 24 mg/mL ketamina, xilacina 2.4 mg/mL). Ketamina/xilacina debe usarse si los animales son menos de 14 días de edad. Si utiliza múltiples animales, extraer el tejido de un animal y lo coloca en DPBS previamente enfriada++ en hielo antes de proceder a los siguientes animales.</li>
	<li>Pellizque un hindpaw y asegurar la insensibilidad completa del animal antes de proceder.</li>
	<li>Transcardially perfusión el animal con 10-30 mL de tampón de la helada de la perfusión mediante una aguja de 27½-G hasta que el búfer funcione claro. Nota: Volumen de perfusión tampón variará dependiendo del tamaño, edad del animal.</li>
	<li>Inmediatamente después de la perfusión, quitar la cabeza del animal. Provenientes de la médula espinal cortada el cóndilo occipital a cada lado con tijeras de disección, tenga cuidado de no dañar el cerebro. Después de cortar cada lado con cuidado, corte para arriba de un lado a lo largo de los parietales y el hueso frontal hacia el hueso nasal. Con pinzas cuidadosamente tire hacia atrás la parte superior del cráneo, rápidamente Retire el cerebro (o estructuras de CNS de interés) y coloque en DPBS previamente enfriada++ en hielo.</li>
	<li>Repita para todos los animales restantes. Nota: Todos los pasos de procedimiento deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas.</li>
</ol>3. mecánica disociación (día 1)
<ol><li>Después de todos los cerebros han sido recogidos, picar un cerebro en trozos de3 1 mm en una placa Petri sobre el hielo con una hoja de bisturí frío y transferir a un homogeneizador dounce helada con 5-7 mL de tampón de douncing helada. Disociar un cerebro en un momento.</li>
	<li>Disociar el tejido con 10-20 movimientos suave e incompletas con un homogeneizador de dounce sueltas. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior de la homogeneizadora, pero en su lugar impulsar el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogenizador.</li>
	<li>Retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Permite trozos de tejido mal disociada a instalarse en la parte inferior de la homogeneizadora y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL refrigerado nuevo.</li>
	<li>Reemplazar el volumen quitado con tampón de douncing fresca y repita los pasos 3.2 y 3.3 para un total de 3-4 rondas o hasta que todo el tejido ha sido disociado. Repita el procedimiento para cada cerebro.</li>
</ol>4. mielina retiro (día 1)
Nota: Eliminación de la mielina se utiliza para el aislamiento de la microglía de animales mayores de P12.
<ol><li>Medir el volumen de la suspensión de células en el tubo cónico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, luego agregar helado douncing tampón para ajustar el volumen total en mL 33,5.</li>
	<li>Añadir 10 mL de tampón de separación de mielina (MSB) a la suspensión de células y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto resultará en una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar las células durante 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento. Nota: La centrífuga debe tomar aproximadamente 1.5-2 min a desacelerarse. Esto generará una capa superior de mielina y restos de células muertas, un sobrenadante algo turbio y un pellet más pequeños que se enriquece para células vivas.</li>
	<li>Quitar la capa superior de la ruina del myelin y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al retirar la capa superior para asegurar que gran parte se elimina como sea posible.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 12 mL de tampón de lavado. Triturate suavemente la suspensión de celular romper cualquier grumos de células que puedan quedar.</li>
</ol>5. Immunopanning (día 1)
<ol><li>Pasar la suspensión celular a través de un colador de celular de 70 μm para eliminar basura grande o grupos de células.</li>
	<li>Enjuagar el plato barrido tres veces con DPBS++OX42 cubierto. No permita que la placa se seque completamente entre lavados.</li>
	<li>Retirar el último lavado DPBS++ y aplique la suspensión filtrada al plato barrido. Suavemente la placa para distribuir las células del remolino, luego Incube la placa en una superficie plana, a temperatura ambiente durante 20 minutos permitir que las células se adhieran. No incubar más de 20 min o células será muy difíciles recuperarse del plato.</li>
	<li>Enjuagar el plato barrido con DPBS++ 10 veces para eliminar las células no adherentes. Microglia será tan firmemente conectada a la placa, agitar la placa con cada enjuague para asegurar el retiro de otras células no adherentes.</li>
	<li>Retirar el último lavado DPBS++ y reemplace con DPBS++ de 15 mL y 200 μL tripsina (solución stock de 1.25%).</li>
	<li>Incubar el plato ≤10 min a 37 ° C con 10% CO2 para trypsinize. Nota: No continúe más de 10 min o microglia será difícil de quitar.</li>
	<li>Después de 10 min de la tripsinización, microglia todavía se ser pegado a la placa. Vierta de tripsina/DPBS++ y lave suavemente 2 x con DPBS++ eliminar tripsina, reemplazar con 12 mL de medio de crecimiento de microglia helada (MGM).</li>
	<li>Lavado plato en hielo durante 2 minutos para ayudar a debilitar la interacción celular/substrato y asegúrese de que el plato es plana para evitar que áreas del plato barrido de la desecación.</li>
	<li>Pipetear enérgicamente con un controlador de pipeta y pipeta 10 mL de alta velocidad para recuperar las células de la fuente de barrido. Dibujar una cuadrícula de 16 x 16 con la corriente de líquido de la pipeta para tratar de eliminar todas las células.</li>
	<li>Compruebe las células bajo un microscopio de 20 aumentos para asegurarse de que las células han separado de la placa. Marcar puntos sobre el plato donde las células se pegan todavía y repita el pipeteo en esas áreas.</li>
	<li>Recoger la suspensión celular y alícuota 3-4 mL del sobrenadante por el tubo cónico de 15 mL. Vuelta por 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento. Nota: Microglia a través de un pequeño volumen de giro permite la recuperación máxima de las células.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mL de MGM con el precipitado de células.</li>
	<li>Resuspender cada precipitado en MGM restante y las células de los tubos de la piscina.</li>
	<li>Contar celdas con hemocitómetro.</li>
	<li>Células de la placa como se describe en los pasos 6 - 7 dependiendo de la aplicación.</li>
	<li>Células en cultivo a 37 ° C con 10% CO2. Nota: Las células pueden ser cultura para hasta 3-4 semanas con cambios regulares de los medios de comunicación o una semana sin cambios de los medios de comunicación.</li>
</ol>6. punto capa las placas de cultivo de tejidos/cubreobjetos (día 1)
<ol><li>Placa de 15 μl de la capa de colágeno IV en el centro de una placa de cultivo de tejidos recubiertos 24-pozo aniónico/catiónico (para detalles, véase Tabla de materiales ) e incubar por 15 min a 37 ° C con 10% CO2.</li>
	<li>Después de contar las células con hemocitómetro diluir las células a 2.3 x 105/ml en MGM. Aspirar en lugar de colágeno IV y placa 15 μl de la suspensión celular a este lugar; Esto le dará 3.5 x 103 células/punto. Incubar durante 5-10 min a 37 ° C con 10% CO2 para permitir que las células se adhieren, Añadir 500 μl de CO2 -equilibrado que contiene medio de crecimiento TGF-β2 y IL-34/colesterol (TIC) suavemente hacia el pozo.</li>
	<li>Si la galjanoplastia en cubreobjetos, primera capa cubreobjetos de vidrio estéril con 10 μg/mL estratagema-D-lisina (PDL) en H2O por 1 h a temperatura ambiente, lavar 3 veces con H2O y dejar secar en una campana bajo luz UV. Una vez seco cubreobjetos, proceder con la galjanoplastia del punto sobre el cubreobjetos como se describe en el paso 6.2.</li>
</ol>7. recubrimiento para el aislamiento de RNA/proteína
<ol><li>El día 1, capa toda la zona de un 24-pozo aniónico/catiónico revestido en placa de cultivo de tejidos con la capa de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO2, luego retire e inmediatamente la placa 3-5 x 104 células/pozo en CO2 equilibrado Medios de comunicación TIC.</li>
	<li>En el día 2, realizar un cambio de media de 50% para cada uno bien el día después de la preparación. Las células muertas tienden a cluster en el centro del pozo, así que los medios de comunicación a partir de ahí.</li>
	<li>Realizar un cambio de media de 50% cada 2-3 días para mantener los cultivos. Si los cambios de los medios de comunicación introducen una variable no deseada de las culturas, las células pueden sobrevivir aproximadamente una semana sin ningún cambio de los medios de comunicación, frente a más de 3 semanas con mantenimiento regular.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura8. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C...

Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad1. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la5 . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos6. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva7. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal8. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características6, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato - encefálica9.
Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis9 a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood - brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.
Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada9. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 - P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.

<table><tbody><tr><td>Rat: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Goat polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone from milk solids</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plates&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stock reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:25,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oleic acid/Gondoic acid</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 50 &amp;mu;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 200 &amp;mu;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &amp;mu;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &amp;mu;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &amp;mu;g/mL insulin, 100 &amp;mu;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite&lt;br/&gt; Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td></tr><tr><td>Collagen IV Coating</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing 2 &amp;mu;g/mL collagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl2, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl2&lt;br/&gt; Comments: Mix well after the addition of&amp;nbsp; CaCl2 and MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &amp;mu;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &amp;mu;g/mL heparan sulfate, 0.1 &amp;mu;g/ml oleic acid, and 0.001 &amp;mu;g/ml gondoic acid&lt;br/&gt; Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &amp;deg;C and do not add more than 1.5 &amp;mu;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.

Este protocolo describe un método de cultura alta pureza ramificado microglia de ratas juveniles. Resultados similares pueden obtenerse utilizando animales inmaduros, perinatales y adultos, como se explica a continuación. Desde aislamientos celulares suelen incluyen matices sutiles y muchas oportunidades para que las células mueren, usamos puntos de control de calidad para ayudar a determinar el éxito en varios pasos. Normalmente supervisamos suspensiones celulares usando un hemocitó...

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Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K vistas.  Stanford University. Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Investigación

Inmunología e Infección

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Neurociencias

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

Source: Jebelli, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52983">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

Eliminación selectiva de la microglía de un cultivo de neuronas de gránulos cerebelosos de rata

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Instruments, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Aislamiento y cultivo de microglía a partir de cerebros de rata utilizando medios sin suero

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Primary Neuronal Culture

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...