Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Christopher e Dana Reeve Foundation International Research Consortium na lesão da medula espinhal, o Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, Fundação JPB, o Instituto Novartis de pesquisas básicas, contribuições generosas de Vincent e Stella Coates e o Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Todos os procedimentos envolvendo roedores em conformidade com as diretrizes da Universidade de Stanford, que estejam em conformidade com políticas e leis estaduais e nacional. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo painel administrativo da Universidade de Stanford no cuidado do Animal de laboratório.
Nota: Todas as composições de buffer e solução são fornecidas na Tabela de materiais.
1. preparar um prato de Petri para Immunopanning CD11b (dia 0)
Nota: Prepare 1 prato de immunopanning para cada cérebro de rato juvenil de 1-2.
<ol><li>Adicione 25 mL de solução de Tris pH 9,5 de 50 mM para uma placa de Petri 15 cm.</li>
	<li>Adicione o anti-rato de cabra IgG (correntes de H + L) para o prato para uma concentração final de 6 µ g/mL. Redemoinho-placa para distribuir uniformemente.</li>
	<li>Incubar o prato para 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Pratos de lavar três vezes com DPBS ++ (fosfato salino (PBS) com Ca2 + e Mg2 +), em seguida, substituir com uma solução de tampão contendo 1 µ g/mL OX42 anticorpo de garimpar. Deixe os pratos durante a noite em temperatura ambiente sobre uma superfície plana.</li>
</ol>2. tecido coleção (dia 1)
Nota: Este protocolo deve tomar ~ 3-4 h.
<ol><li>Antes de começar, certifique-se de todas as soluções são estéreis e refrigerados no gelo. Relaxa todos os instrumentos no gelo e esterilizar com etanol antes de usar.</li>
	<li>Seguintes procedimentos regulamentares adequados, sacrificar um rato de laboratório juvenil por asfixia de dióxido de carbono. Nota: Como alternativa, animais mais jovens podem ser sacrificados com uma dose letal de cetamina/xilazina (100-200 µ l de 24mg/mL cetamina, xilazina 2,4 mg/mL). Xilazina/cetamina deve ser usada se os animais são menos de 14 dias de idade. Se usar vários animais, extrair o tecido de um animal e colocá-lo em pre-refrigerados DPBS ++ no gelo antes de prosseguir para animais subsequentes.</li>
	<li>Beliscar um hindpaw e assegurar a completa apatia do animal antes de prosseguir.</li>
	<li>Transcardially perfundir o animal com 10-30 mL de tampão de perfusão gelada usando uma agulha de 27½-G até o tampão funciona claro. Nota: O Volume da reserva de perfusão pode variar dependendo da tamanho/idade do animal.</li>
	<li>Imediatamente após a perfusão remova a cabeça do animal. Vindo da medula espinhal, corte o côndilo occipital de cada lado com uma tesoura de dissecação, tenha cuidado para não danificar o cérebro. Após o corte cada lado corte cuidadosamente, por um lado, ao longo do parietal e osso frontal para o osso nasal. Com pinça puxe o topo do crânio, rapidamente Retire cuidadosamente o cérebro (ou estruturas de CNS de interesse) e coloque no pre-refrigerados DPBS ++ no gelo.</li>
	<li>Repita para todos os restantes animais. Nota: Todas as etapas do processo devem ser realizadas em uma capa de fluxo laminar, sob condições estéreis.</li>
</ol>3. mecânica dissociação (dia 1)
<ol><li>Depois que todos os cérebros foram recolhidos, cortar um cérebro em pedaços de3 de 1 mm em um prato de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi frio e transferir para um homogenizador homogenizacao gelada com 5-7 mL de tampão de douncing gelada. Dissocia um cérebro de cada vez.</li>
	<li>Dissocia o tecido através de movimentos de suaves e incompletos de 10-20 com um homogeneizador de homogenizacao folgadas. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogenizador, mas em vez disso, impel o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogenizador.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permitir que pedaços de tecido mal dissociada a ajustar-se ao fundo o homogenizador e transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico refrigerado 50 mL.</li>
	<li>Substituir o volume removido com buffer de douncing fresco e repita as etapas de 3.2 e 3.3, para um total de 3-4 rodadas, ou até que todo o tecido tem sido dissociado. Repita o procedimento para cada cérebro.</li>
</ol>4. a mielina remoção (dia 1)
Nota: Remoção de mielina é usada para a isolação de micróglia de animais mais velhos que P12.
<ol><li>Medir o volume da suspensão celular no tubo cónico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL e, em seguida, adicione douncing gelada buffer para ajustar o volume total de 33,5 mL.</li>
	<li>Adicione 10 mL de tampão de separação de mielina (MSB) para a suspensão de células e misture cuidadosamente o tubo várias vezes por inversão. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta. Nota: A centrífuga deve tomar aproximadamente 1.5-2 min para desacelerar. Isso irá gerar uma camada superior de mielina e restos de células mortas, um sobrenadante um pouco turva e uma menor pelota que é enriquecida por células vivas.</li>
	<li>Remova a camada superior da mielina/detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir como muito do que é removido quanto possível.</li>
	<li>Ressuspender as células em 12 mL de tampão de garimpar. Delicadamente, Triture a suspensão de eritrócitos para quebrar qualquer aglomerados de células que possam permanecer.</li>
</ol>5. Immunopanning (dia 1)
<ol><li>Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm para remover detritos grandes ou aglomerados de células.</li>
	<li>Enxague o prato panning revestido OX42 três vezes com DPBS ++. Não permitir que a placa completamente seco entre lavagens.</li>
	<li>Deite fora a última lavagem DPBS ++ e aplicar a suspensão de células filtrada para o prato de panning. Suavemente agitar a placa para distribuir as células e, em seguida, incubar a placa sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 min permitir que as células a aderir. Não incubar mais do que 20 min ou células se tornará muito difícil recuperar do prato.</li>
	<li>Enxague o prato panning com DPBS ++ 10 vezes para remover as células não-aderentes. Microglia será tão firmemente ligado à placa, agite a placa com cada enxágue para assegurar a remoção de outras células não-aderentes.</li>
	<li>Deite fora a última lavagem DPBS ++ e substitua com 15 mL DPBS ++ e 200 tripsina μL (1,25% solução estoque).</li>
	<li>Incube o prato para ≤ 10 min a 37 ° C, com 10% de CO2 para trypsinize. Nota: Não faça mais do que 10 min ou micróglia se tornará difícil de remover.</li>
	<li>Após 10 min de tripsinização, microglia ainda vai ser preso à placa. Decantar a tripsina/DPBS ++ e lave suavemente 2x com DPBS ++ para remover a tripsina, substituir com 12 mL de meio de crescimento microglia gelada (MGM).</li>
	<li>Garimpando o prato no gelo por 2 min para ajudar a enfraquecer a interação célula/substrato e certifique-se o prato é plana para evitar áreas do prato panning sequem.</li>
	<li>Pipetar vigorosamente com um 10 mL pipeta e pipeta controlador de alta velocidade para recuperar células do prato panning. Desenhe uma grade de 16 x 16 com o fluxo do líquido da pipeta para tentar remover todas as células.</li>
	<li>Verifique as células sob um microscópio ampliação de 20 X para certificar-se de células têm separada da placa. Marca pontos em cima do prato onde as células ainda estão presos e repetição de pipetagem nessas áreas.</li>
	<li>Recolha a suspensão de células e alíquota 3-4 mL do sobrenadante por tubo cônico de 15 mL. Rotação por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta. Nota: Microglia através de um pequeno volume de giro permite a máxima recuperação das células.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mL da MGM com o centrifugado.</li>
	<li>Cada Ressuspender em MGM restante e as células de todos os tubos da piscina.</li>
	<li>Contar as células com hemocytometer.</li>
	<li>Células de placa conforme descrito nos passos 6 - 7, dependendo da aplicação.</li>
	<li>Células de cultura a 37 ° C, com 10% de CO2. Nota: As células podem ser cultura para até 3-4 semanas com mudanças regulares de mídia ou uma semana sem alterações de mídia.</li>
</ol>6. lugar revestimento placas de cultura de tecidos/lamelas (dia 1)
<ol><li>Placa de 15 µ l de revestimento de colagénio IV directamente no centro de uma placa de cultura de tecido revestido 24-bem aniônicos catiônicos (consulte Tabela de materiais para obter detalhes) e incube por 15 min a 37 ° C, com 10% de CO2.</li>
	<li>Depois de contar células com hemocytometer dilua as células para 2.3 x 105/mL, no MGM. Aspire o colagénio IV spot e imediatamente placa 15 µ l de suspensão de células para este ponto; Isto dará 3.5 x 103 células/spot. Incube durante 5-10 min a 37 ° C, com 10% de CO2 para permitir que as células aderem, adicionar 500 µ l de CO2 -equilibrado meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC) suavemente para o poço.</li>
	<li>Se chapeamento em lamelas, primeiro casaco lamelas de vidro estéril com 10 µ g/mL estratagema-D-lisina (PDL) em H2O por 1h no RT, lavar 3 vezes com H2O e deixe secar em um capuz sob luz UV. Uma vez que as lamelas são secas, prossiga com chapeamento local sobre as lamelas conforme descrito no passo 6.2.</li>
</ol>7. chapeamento para isolamento de RNA/proteína
<ol><li>No dia 1, casaco, toda a área de uma 24-bem aniônicos/catiônica revestido com placa de cultura de tecido com revestimento de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C, com 10% de CO2, retire e imediatamente placa 3-5 x 104 células/poço em CO2 incubado Mídia TIC.</li>
	<li>No dia 2, realizar uma alteração de mídia de 50% para cada um bem no dia após o preparo. Células mortas tendem a cluster no centro do poço, então assumo o mídia.</li>
	<li>Realizar uma alteração de mídia de 50% a cada 2-3 dias para manter as culturas. Se alterações mídia introduzirem uma variável indesejada para as culturas, as células podem sobreviver por cerca de 1 semana sem qualquer alteração de mídia, em oposição a mais de 3 semanas com uma manutenção regular.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Porque microglia servem como as células imunes Sentinela do SNC, eles são altamente sensíveis às mudanças ambientais; Portanto, muito cuidado é necessário para minimizar as respostas inflamatórias dentro das células durante seu isolamento e cultura8. Isso é feito no presente protocolo através de velocidade e temperatura. Sempre que possível reduz a ativação, para que todas as etapas de centrifugação ocorrem a 4 ° C, mantendo as células no gelo ou a 4 ° C, os animais são pintado...

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença1, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão5 . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.
Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos6. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo7. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto8. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características6, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato - encefálica,9.
Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose9 muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue - cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.
Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado9. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 - P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.

<table><tbody><tr><td>Rat: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Goat polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone from milk solids</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plates&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stock reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:25,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oleic acid/Gondoic acid</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 50 &amp;mu;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 200 &amp;mu;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &amp;mu;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &amp;mu;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &amp;mu;g/mL insulin, 100 &amp;mu;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite&lt;br/&gt; Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td></tr><tr><td>Collagen IV Coating</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing 2 &amp;mu;g/mL collagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl2, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl2&lt;br/&gt; Comments: Mix well after the addition of&amp;nbsp; CaCl2 and MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &amp;mu;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &amp;mu;g/mL heparan sulfate, 0.1 &amp;mu;g/ml oleic acid, and 0.001 &amp;mu;g/ml gondoic acid&lt;br/&gt; Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &amp;deg;C and do not add more than 1.5 &amp;mu;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia representam 5-10% de todas as células do sistema nervoso central (SNC) e são cada vez mais atenção devido a suas contribuições durante o desenvolvimento, homeostase e doença. Embora os macrófagos têm sido estudados em detalhe por décadas, recursos especializados de micróglia, os macrófagos de tecido-residente do SNC, mantiveram-se em grande parte misteriosa, em parte devido às limitações na habilidade de recapitular microglial maduro Propriedades em cultura. Aqui, podemos ilustrar um procedimento simples para o isolamento rápido de puro microglia no cérebro de roedor maduro. Descrevemos também condições de cultura livre de soro que suportam níveis elevados de microglial viabilidade ao longo do tempo. Microglia cultivada sob essas condições definidas e médias apresentam elaborados processos ramificados e comportamento dinâmico de vigilância. Podemos ilustrar alguns efeitos de exposição de soro na microglia culta e discutir como essas culturas isento de soro comparam com culturas expostas ao soro, bem como micróglia em vivo.

Este protocolo descreve um método de cultura alta pureza ramificada microglia de ratos jovens. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando animais imaturos, perinatais e adultos, como discutido abaixo. Desde que os isolamentos de célula frequentemente incluem nuances sutis e muitas oportunidades para as células a morrer, usamos pontos de verificação de controle de qualidade para ajudar a determinar o sucesso em várias etapas. Nós normalmente monitorados suspensões celulares us...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K visualizações.  Stanford University. Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Vídeo: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurociência

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

Source: Jebelli, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52983">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

Remoção seletiva de microglia de uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares de rato

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Instruments, ...

Co-culture and Interaction Studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...