Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Bu eser Christopher ve Dana Reeve Vakfı Uluslararası Araştırma Konsorsiyumu Medulla Spinalis Yaralanmalarında, Dr Miriam ve Sheldon G. Adelson tıbbi araştırma Vakfı, JPB Vakfı, Novartis temel Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, cömert katkıları Vincent ve Stella Coates ve Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (DRG-2125-12).

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.
Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.
1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın
Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.
<ol><li>25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.</li>
	<li>Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirler) yemek 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Eşit dağıtmak için plaka girdap.</li>
	<li>Yemek için 1-3 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Durulama yemekleri üç kez ile DPBS++ (fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) Ca2 + ve Mg2 +ile), daha sonra 1 µg/mL OX42 antikor içeren arabellek kaydırma bir çözüm ile değiştirin. Gecede, oda sıcaklığında bulaşıkları düz bir yüzeye bırak.</li>
</ol>2. doku koleksiyonu (1 gün)
Not: Bu protokol ~ 3-4 h almalıdır.
<ol><li>Başlamadan önce tüm çözümler steril ve soğutulmuş buz üzerinde olduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde sakin ve etanol ile kullanmak için önceden sterilize.</li>
	<li>Aşağıdaki uygun yasal prosedürleri, karbon dioksit boğulma tarafından bir çocuk laboratuvar sıçan kurban. Not: Alternatif olarak, ketamin/xylazine (100-200 µL 24 mg/mL ketamin bas, 2.4 mg/mL xylazine) öldürücü bir doz ile genç hayvanlar kurban. 14 günden daha az sürede hayvanlardır ketamin/xylazine kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, bir hayvandan dokuya ayıklamak ve buz sonraki hayvanlar geçmeden önce önceden soğutulmuş DPBS++ yerleştirin.</li>
	<li>Bir hindpaw tutam ve devam etmeden önce hayvan tam yanıt vermeyi durdurma sorununu sağlamak.</li>
	<li>Transcardially buz gibi perfüzyon arabellek arabellek açık bitene 27½-G iğne kullanarak 10-30 mL hayvanla sıvı. Not: Perfüzyon arabellek hacmi hayvan boyutu/yaş bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Hemen perfüzyon sonra hayvan başkanı kaldırın. Omurilik oksipital düzgün her iki tarafta diseksiyon makasla kesme gelen, beyin zarar vermemeye dikkat et. Kesmek sonra her tarafı dikkatle, Paryetal ve frontal kemik Burun kemiği doğru boyunca parça parça kesin. Forseps ile dikkatli bir şekilde geri kafatasının üst çekin, hızlı bir şekilde beyin (veya ilgi CNS yapıları) kaldırmak ve önceden soğutulmuş DPBS++ buzda yerleştirin.</li>
	<li>Tüm kalan hayvanlar için yineleyin. Not: Tüm devam etmeden adımları laminar akış başlıklı uygun steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
</ol>3. mekanik ayrışma (1 gün)
<ol><li>Tüm beyin topladıktan sonra bir beyin bir soğuk neşter bıçakla buzda Petri kabına 1 mm3 parçalar halinde doğrayın ve bir buz gibi dounce homogenizer 5-7 mL buz gibi douncing arabellek ile aktarın. Bir beyin bir zaman ayırmak.</li>
	<li>10-20 nazik ve eksik vuruş ile gevşek-montaj dounce homogenizer kullanarak doku ayırmak. Değil doğrudan homogenizer alt doku ezmek, ama bunun yerine doku piston kenarlarına ve homogenizer arasındaki boşluğu ile itmek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Pistonlu Hava kabarcıkları giriş önlemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Kötü Disosiye doku parçaları homogenizer altına yerleşmek izin ve süpernatant bir yeni soğutulmuş 50 mL konik tüp için transfer.</li>
	<li>Kaldırılan birimin taze douncing arabellek ile değiştirin ve 3,2 3,3 için toplam 3-4 tur veya tüm doku ayrışmış kadar aygıtlarından. Her beyin için yordamı yineleyin.</li>
</ol>4. miyelin kaldırma (1 gün)
Not: Miyelin kaldırma microglia hayvanlardan P12 büyük yalıtım için kullanılır.
<ol><li>Hücre süspansiyon 25 mL pipet kullanarak 50 mL konik tüp hacmi ölçmek, sonra buz gibi douncing arabellek 33,5 ml toplam ses seviyesini ayarlamak için ekleyin.</li>
	<li>Miyelin ayrılık arabellek (MSB) 10 mL hücre süspansiyon için iyice tüp birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. Bu da % 23 bir son konsantrasyon MSB 43,5 mL hacminde yol açar.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Santrifüj yaklaşık 1,5-2 yavaşlatmak için dakika sürer. Bu miyelin ve ölü hücre artıkları, biraz bulanık süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş bir daha küçük Pelet üst tabakası oluşturur.</li>
	<li>Miyelin/enkaz ve süpernatant bir pipet ile üst katmanı kaldırın. Daha bunun mümkün olduğunca kaldırılır olarak sağlamak için üst tabaka kaldırırken ilgilen.</li>
	<li>Hücre Pelet arabellek kaydırma 12 mL içinde resuspend. Yavaşça kalmış olabilecek hücreleri herhangi bir kümeleri kadar kırmak için hücre süspansiyon triturate.</li>
</ol>5. Immunopanning (1. gün)
<ol><li>Hücre süspansiyon büyük enkaz veya hücre kümeleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
	<li>Üç kez DPBS++ile OX42 kaplı kaydırma çanak durulayın. Plakasına izin vermeyen yıkar arasında tamamen kuru.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve filtre uygulanmış hücre süspansiyon kaydırma yemek için geçerlidir. Yavaşça hücreleri dağıtmak için plaka girdap, sonra plaka hücreleri bağlı kalmak izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kuluçkaya. 20 dk daha uzun kuluçkaya değil veya hücreleri yemek kurtarmak çok zor olacak.</li>
	<li>DPBS++ ile kaydırma çanak yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için 10 kez yıkayın. Microglia-ecek var olmak sıkıca plaka bağlı, bu yüzden diğer yapışık olmayan hücreleri kaldırılmasını sağlamak için her durulama ile plaka girdap.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve 15 mL DPBS++ ve 200 μL tripsin (%1.25 stok çözelti) adıyla değiştirin.</li>
	<li>Yemek için ≤10 min trypsinize için % 10 CO2 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 10 dk daha uzun süre devam etmeyin veya microglia kaldırmak zor olacak.</li>
	<li>Trypsinization, 10 dakika sonra microglia hala plakasına kalmış olacak. 2 x tripsin kaldırmak, buz gibi microglia büyüme orta (MGM) 12 mL ile değiştirmek için DPBS++ ile nazikçe yıkayın ve tripsin/DPBS++ dökün.</li>
	<li>Hücre/substrat etkileşim zayıflatmak ve yemek emin olun yardım için tabak 2 min için buz üzerinde kaydırma kaydırma çanak alanlarında kurumasını önlemek için düz yerdir.</li>
	<li>Şiddetle kaydırma çanak hücreleri kurtarmak için bir 10 mL pipet ve damlalıklı denetleyicisinde yüksek hız ile pipet. 16 x 16 kılavuz sıvı akışı ile denemek ve tüm hücre kaldırma pipet çizin.</li>
	<li>Hücreleri tabaktan ayırdıktan emin olmak için 20 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Mark noktalar nerede hücreleri hareketsiz şaşırıp kalmış yemeğin üstüne ve tekrar bu alanlarda pipetting.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve aliquot 3-4 mL başına 15 mL konik tüp süpernatant toplamak. 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika çevir. Not: microglia küçük bir birim aracılığıyla iplik için hücre kurtarma maksimum sağlar.</li>
	<li>MGM 0.5 mL ile hücre Pelet bırakarak süpernatant, Aspire edin.</li>
	<li>Her Pelet içinde kalan MGM resuspend ve tüpler hücrelerden Havuzu.</li>
	<li>Hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Adım 6 - 7 uygulamaya bağlı olarak açıklandığı gibi plaka hücreleri.</li>
	<li>Kültür hücreleri 37 ° c % 10 CO2. Not: Hücreler kültür için ilâ 3-4 hafta düzenli medya değişikliklerle veya medya değişiklik ile bir hafta olabilir.</li>
</ol>6. spot doku kültürü plakaları/Coverslips (gün 1) kaplama
<ol><li>Kollajen IV kaplama doğrudan bir 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü tabak merkezinde 15 µL plaka ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız) ve % 10 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Hemasitometre hücrelerle sayım sonra 2.3 x 105/mL MGM hücrelere oranında seyreltin. Kollajen IV spot ve hemen plaka 15 µL hücre süspansiyon bu noktaya Aspire edin; Bu 3,5 x 103 hücreleri/spot verecektir. 5-10 dk 37 ° c % 10 CO2 hücreler uygun, TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC) CO2-500 µL equilibrated eklemek izin vermek için hafifçe kuyuya kuluçkaya.</li>
	<li>Eğer coverslips, ilk kat steril cam coverslips ile 10 µg/mL manevra-D-lizin (PDL) H2O RT, 1 h için kaplama 3 kez H2ile O yıkama ve bir başlık UV ışık altında kurumaya bırakın. Coverslips üzerine spot kaplama coverslips kuru olduğunda, adım 6.2 içinde açıklandığı gibi devam edin.</li>
</ol>7. RNA/Protein izolasyon kaplama
<ol><li>104 hücreleri/iyi CO2 gün 1, bir 24-şey Anyonik/Katyonik tüm alan doku kültürü plaka kollajen IV kaplama ile kaplı ve için 10 dk - 1 h % 10 CO2, 37 ° C'de kuluçkaya sonra kaldırmak ve hemen 3-5 x plakası kat equilibrated TIC medya.</li>
	<li>2 günde bir % 50 medya değişiklik her biri için de bir gün sonra hazırlık yapmak. Ölü hücreleri iyi ortasında küme, bu yüzden oradan medya almak eğilimindedir.</li>
	<li>Kültürleri korumak için 2-3 günde bir % 50 medya değişiklik yapmak. Ortam değişikliğine kültürler için istenmeyen bir değişken varsa, hücreleri yaklaşık 1 hafta 3 hafta düzenli bakım ile karşı herhangi bir medya değişiklik olmadan hayatta kalamaz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür8sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon periosteum ve protokol doku arasındaki süreyi en aza indirmek için düzenlenmiştir çıkarma ve hücreleri kültür. Gen ifade desenleri taze izole hücre değerlendirmek, hücre lysates doğrudan doğruya--dan CD11b immunopanning yemek trypsinization en azından yalıtım kaynaklı değişiklikleri tutmak için önce hasat. Bu unutulmamalıdır bu bile dikkatli bir şekilde izole microglia hemen sonra muhtemelen nedeniyle tanıma özünde yalıtım yordamı ile ilişkili hasar ilişkili sinyallerin ılık sıcaklıklarda yerleştirilen bir enflamatuar yanıt yürütmek. Protokol başarıyla gerçekleştirildi, 2.5-5 x 105 hücreleri/çocuk sıçan bekleniyor.
Hücre izolasyon Protokolü burada son derece belirli hücreleri CD11b + perfused CNS9yalıtmak için sağlanan. Her ne kadar bu hücre nüfus ağırlıklı olarak microglia oluşan, Ayrıca diğer myeloid nüfus Perivasküler makrofajlar, meninjeal makrofajlar, choroid plexus makrofajlar, monosit ve nötrofil10gibi düşük seviyelerde içerir. Koroid ilişkili Miyeloid hücreleri aslında tanıma ve doku ayrılma öncesinde choroid plexus kaldırılması ortadan kaldırılabilir. Meninkslerde de bir ölçüde kaldırılabilir, ama tüm meninjeal doku ortadan kaldırılması tam burada açıklanan hızlı yalıtım için hedeflenen zaman dilimleri içinde pratik değildir. Bu nedenle, değişkenlik meninkslerde eksik kaldırılması nedeniyle sınırlamak için biz meninkslerde kaldırmaz. Monosit/nötrofil izole malzeme içinde dolaşan sayısını en aza indirmek için aynı zamanda temiz bir perfüzyon önemlidir ve biz genellikle kötü derin doku atın. Bile mükemmel perfüzyon ile izni kan varlığı eritrositler arıtma boyunca hücre topakları içinde küçük bir miktar ile belirgin olarak mutlak değildir. Böylece, nötrofil ve monosit küçük seviyesini co saflaştırılmış ve farklı bir imza taze izole hücre transcriptomic profillerde katkıda bulunmak. Ancak, hücre dolaşan serum-Alerjik TIC medyada hızla ölecek ve onlar hayatta ve kültürleri içeren serum çoğalırlar devam edebilirsiniz, ancak kalıcı kirleticiler, temsil etmemektedir.
Sağlıklı, canlı bir kültür elde etmek için başka bir önemli nokta mekanik ayrışma adımları sırasında dikkat çekmek için olduğunu. Douncing birçok nöronlar, glia ve diğer öldürürken CNS hücreleri, microglia (microglia da bitti-douncing tarafından öldürülmüş olabilir rağmen) nispeten zarar görmeden bu ayrılma hayatta. Eğer doğru yapılırsa, bu iletişim kuralı hücre verimleri o proteolitik ayrılma kullanarak elde edilen karşılaştırılabilir sonuçları, potansiyel olarak doku inflamatuar değişkenleri semptomlarıdır ise yanıt-e doğru yüksek sıcaklıklardaki kaçınılmalıdır. Mekanik doku ayrışma birbirini izleyen eksik mermi gerçekleştirerek, tek hücre süspansiyon genel kültür üzerindeki mekanik stres miktarını en aza indirerek hasat edilebilir.
Burada açıklanan immunopanning Protokolü microglia yalıtmak için bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir yoldur, ama diğer benzer yöntemleri kullanılabilir. Manyetik izolasyon ile manyetik aktif hücre miyelin tükenmesi ve CD11b seçimi sıralama kullanarak benzer sonuçlar elde etmiş olursunuz. En yüksek kalite Kültür tarihi için sağlamıştır, daha az özel ekipman için ve hemen önce kültür hücreleri antikor demir oksit Birleşik giriş gerektirmez çünkü burada immunopanning yöntemi üzerinde odaklanmıştır. Mikroglial yalıtım için yaygın olarak kullanılan başka bir bona fide microglia yüzeyi kullanarak diğer CD11b + Miyeloid kirletici üzerinden arınma için protokoller bulunmaktadır o güncel yaklaşımlar üzerinde büyük bir avantaj olan Akış Sitometresi yaklaşımdır TEMEM1198gibi imza işaretleri karşı antikor. Floresans aktif hücre sıralama sonuçlar son derece saf hücre popülasyonda rağmen aynı zamanda hücreleri için ek stresleri dayatır ve daha düşük canlılık kültürler veya düşük verimleri neden olabilir. Genel olarak, tekrarlanabilirlik ve saflık hücre nüfusunun en üst düzeye çıkarmak için etiket içermeyen yoğunluğu Santrifüjü ve shake-off hazırlıkları üzerinde antikor tabanlı yöntemleri üzerinde odaklanıyoruz.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kültür için optimize edilmiş iken, microglia çeşitli çağlardan kültür için kullanılabilir; Toplam hücre verimleri maksimal mikroglial genişleme zirvesine geçtikten sonra 1 - 2-hafta-yaşlı fareler ve daha önce büyük doku hücrelerinin kurtarma çalışmasına engel yapısal düzenlemeler vardır. Microglia Ayrıca, izole ve fare ve insan dokusu ile fare veya insan epitopları için belirli bir uygun Monoklonal antikor CD11b antikor değiştirerek kültürlü. Fare ve insan microglia Bu kültür koşullarda hayatta kalmak, onlar ne zaman fare hücrelere göre morfolojik farklılıklar gösterir. Fare hücreleri ramified Morfoloji korur ancak insan hücreleri izole ve bu prosedüre göre kültürlü neredeyse tek tip bir protozlar Morfoloji varken süreçler, ayrıntılı bir şeyin yok.
İzole microglia gerekli deneyleri bağlı olarak farklı şekillerde kaplama. (Olarak canlı/ölü deneyleri ve morfolojik filmler burada gösterilen resimli) en iyi sonuçlar için 3.5 x 103 hücreleri kollajen IV bir 10dk kaplama sonra 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka kuyusu ortasına kaplama "nokta" Yukarıdaki Protokolü nitelendirdi. Alternatif olarak, çok sayıda bir yalıtım RNA gibi hücrenin gerektiren deneyler için 3-5 x 104 hücreleri 24-şey plaka kuyu 10 dakika sonra 1 h kollajen IV kaplama kaplama. Biraz daha düşük canlılık gösterdi daha yüksek yoğunlukları hücreleri kaplama ve spot hücrelere kıyasla daha az karmaşık Morfoloji, muhtemelen inflamatuar sinyalleri yanıt yalıtım olarak salgılanan etkisi nedeniyle tedavi. İmmünhistokimya veya cam coverslips gerektiren görüntüleme, hücreleri en iyi hayatta kalma sergi ve coverslips ilk ne zaman Morfoloji PDL ile kaplı sonra yukarıda açıklandığı gibi kolajen IV kaplı. Çok sayıda koşulları gerektiren deneyleri için hücre canlılığı da 96-şey veya 384-şey kolajen kaplı levha yüksektir. Her koşulda, hücreleri yuvarlak veya bipolar başlayın, gün 3-4, etrafında süreçleri elde etmek ve almak 5-10 Resim 1 ve film 1' de gösterildiği sonuna kadar ramified Morfoloji sergilemek yaşam başlar.
Dinamik gözetim davranış ve Morfoloji microglia vivo içindedinlenmek için benzer sergileyen bir kültür bu protokol sonuç varken bu hücreler microglia vivo içindeözel gen ifade imzası tam olarak korumak başarısız. Çok kültürlü hücrelerde gözlenen kalıcı gen değişiklikleri genellikle embriyonik veya kızarmış CNS9' da görülen değişiklikleri yansıtır. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir adım microglia gerektiren kültür ve serum uyarılmış değişiklikleri hayatta kalmak için koşullar anlamada gösterir, ancak ileri çalışmalar mikroglial ince ayar MSS tarafından sağlanan dışsal sinyalleri anlamak için gerekli özellikleri ve gen ifadesi.

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik1çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.
Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar6. Microglia--dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis7katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta8elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan - beyin bariyerini9tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri6, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.
CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan - beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz9 vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş9' a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 - P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.

<table><tbody><tr><td>Rat: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Goat polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone from milk solids</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plates&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stock reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:25,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oleic acid/Gondoic acid</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 50 &amp;mu;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 200 &amp;mu;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &amp;mu;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &amp;mu;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &amp;mu;g/mL insulin, 100 &amp;mu;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite&lt;br/&gt; Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td></tr><tr><td>Collagen IV Coating</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing 2 &amp;mu;g/mL collagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl2, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl2&lt;br/&gt; Comments: Mix well after the addition of&amp;nbsp; CaCl2 and MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &amp;mu;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &amp;mu;g/mL heparan sulfate, 0.1 &amp;mu;g/ml oleic acid, and 0.001 &amp;mu;g/ml gondoic acid&lt;br/&gt; Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &amp;deg;C and do not add more than 1.5 &amp;mu;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (şekil 1A) adlı bir hemasitometre kullanarak hücre süspansiyonlar izlenir. Başarılı izolasyonların 2.5-5 x 105 hücreleri/çocuk hayvan verim. 2. 5 x 105 hücreleri/hayvan için verimleri daha yakın hayvanlardan P30 büyük izole hücreleri gösterir, ancak P7 - P15 hayvanlardan verimleri daha yakın 5 x 105 hücreleri/hayvan, göster. Toplam hücre izleme ötesinde sayar Protokolü ' nün boyunca bu şekilde izole microglia var çünkü yuvarlak veya bipolar Morfoloji kültüründe ilk birkaç gün boyunca zor olabilir izole hücre, genel sağlık belirlemek önemlidir . Burada, biz P25 microglia görüntülerini faz kültüründe yalıtım TIC ve % 10 fetal buzağı serum (FCS) (şekil 1B) içeren TIC sonra ilk 6 gün boyunca eklemiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig1.jpg"> Şekil 1: hücre sağlık yalıtım protokol sırasında ve 6 gün kültür değerlendirilmesi. (A)faz kontrast görüntüler hücre izolasyon yordam belirtilen adımları gösteren kalite kontrol noktalarında. Hücresel süspansiyonlar hücresel süspansiyon 9 µL % 0,4 trypan mavi bir hemasitometre üzerine yüklemeden önce 1 µL ile karıştırılarak görüntüsü. Kaydırma çanak diğer resimleri göster ve tüm görüntüleri 20 X büyütme, tek bir alan olarak gösterilir. Ölçek çubuğu, 200 µm. MGM, microglia büyüme orta. (B) saat ders mikroglial morfolojik değişiklikler ve nükleer silahların yayılmasına karşı 6 gün kültür Serumda serum-Alerjik TIC büyüme orta veya TIC artı % 10 fetal buzağı (FCS). CD11b-immunopanned hücreleri spot kollajen kaplı Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka üzerinde kaplama ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), ve aynı alanda faz-kontrast her 24 h ölçek bar, 100 µm. TIC, TGF-B2/IL-34 tarafından yansıma / Kolesterol içeren büyüme orta. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57122/57122fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rutin değerlendirme sağlık ve canlılık izole hücre tekrarlanabilirlik ve deneyler başarısı için önemlidir. İşte MGM, TIC veya 7 gün vitro (DIV) bir canlılık tahlil ile sonra % 10 FCS ile desteklenmiş TIC kültürlü bir P21 hayvan izole microglia göstermektedir. Yalıtım başarılı olursa, kültürler arasında % 80-90 canlılığı ancak bu yapay olarak her ikisi için de hızlı yayılması şişirilir 7 DIV. varlığında serum sonunda kültürlü hücreleri bu ölçü tarafından % 100 canlılığı yakınındaki tırmanmaya sonra TIC içinde göster Serum Günese maruz kalan hücreleri ve hızlı fagositoz ölü hücre içinde bu kültürler (şekil 2A). Ek olarak güçlü hayatta kalma, kültürlü TIC hücreleri de hücreleri (şekil 2B, C) bir ramified Morfoloji FCS için karşılaştırıldığında tedavi gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig2.jpg"> Şekil 2: yaşama microglia MGM, TIC veya TIC + FCS yedi gün içinde kültür. (A)hücreleri P21 sıçanlarından emir izole edildi ve kültürlü microglia büyüme orta (MGM), TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC), veya TIC + % 10 fetal buzağı serum (FCS). Her zaman noktada kültür orta calcein AM (1.33 µM final) ve etidyum homodimer (2.5 µM son) canlı hücreleri ve ölü hücreleri sırasıyla etiketlemek 15 dakika ile takıma. Hücreleri otomatik bir ImageJ komut dosyası kullanarak her alanda sayıldı. (B ve C) 7 DIV, sonra herhangi bir medya değişiklik ile hücreleri yetişen TIC (B) veya % 10 FCS (C) ile desteklenmiş TIC yukarıdaki gibi canlı ve ölü hücreleri etiketlemek için lekeli. Temsilcisi görüntüleri 10 X (sol) veya 40 X (sağda) amacı istimal alındı. Ölçek çubuğu, standart hata (SEM) ortalamaya 40 µm. hata çubukları temsil eder. Bu rakam Bohlen ve ark. güncellenmiştir 9 ve izni ile kullanılır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57122/57122fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Başarılı izolasyonu ve kültürü son derece saf microglia göstermek için biz microglia P21 fareler gelen izole ve TIC veya % 10 FCS ile 8 gün boyunca takıma TIC bu hücreler kültürlü. Hücreler daha sonra sabit ve mikroglial işaretleri (Iba-1 ve CD11b) ve nükleer silahların yayılmasına karşı marker (Ki67, şekil 3A) ile lekeli. Hücre işaretler için boyama ek olarak, RNA-seq taze izole hücreleri üzerinde hücrelerin RNA profil değerlendirmek için güçlü ve hassas bir araç sağlar ve kültürlerin başlangıç saflık bilgilendirmek yardımcı olabilir. CD11b immunopanning genellikle CD11b küçük bir yüzdesi sonuç+ CD11b ek olarak nötrofil/monosit ertelenmiş+ microglia (şekil 3B). Bu hücreler TIC içinde bir kaç gün sonra ölecek ama daha önceki zaman noktaları analizlerini karmaşık hale getirebilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig3.jpg"> Şekil 3: saflık biçilen immünhistokimya ve RNA-devamı olarak kültürlü hücrelerinin (A)Microglia PDL/kolajen kaplı cam coverslips kaplama ve TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme ortamda (TIC) 8 gün boyunca kültürlü P21 fareler, yalıtılmış. Hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) oda sıcaklığında 10 dakika ile sabit ve bağışıklık lekeli Iba-1 ile (1:500), CD11b (1:1500) ve Ki67 (1:500). Kısaca, sabit hücrelerin % 0,1 deterjan ile bloke edildi (Ayrıntılar için yöntemleri tabloya bakın) ve % 10 normal eşek serum (NGS) oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri sonra birincil antikor NGS gecede 4 ° C'de % 1 ile % 0,1 deterjan ile inkübe Hücreleri 5 dk her PBS için üç kez yıkanmış. Hücreleri sonra tüm %1:500 1 ile % 0,1 deterjan ikincil antikorlar ile inkübe NGS oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri olduğunu tekrar PBS içinde üç kez yıkanmış ve montaj orta DAPI içeren monte. Temsilcisi görüntüleri 40 X büyütme oranında alındı. Ölçek bar, 50 µm. (B) temsilcisi hücre tipi belirli transkript taze izole ve kültürlü hücreleri tarafından ifadesi. Microglia P21 sıçanlarından emir izole ve doğrudan doğruya--dan immunopanning çanak RNA izolasyonu için lysed ve en az kirlenme diğer büyük CNS hücre tiplerinin (astrocytes, nöronlar, oligodendrocytes ve endotel hücreleri) RNA-seq. işaretleyicileri göster CD11b-immunopanned hücreleri. Nötrofil işaretleri taze izole hücrelerde (siyah) tespit edilir, ancak serum-Alerjik kültürlerde (gri) kazandı. Kültürlü hücreleri ortak makrofaj işaretleri düzeyi yüksek hızlı, ama özel mikroglial imza tanımlama işaretleri, hızlı bir şekilde downregulated kültürlü hücreleri tarafından vardır. Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Veri Bohlen ve ark. değiştirilir 9 ve izni ile kullanılır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57122/57122fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Canlılık ve hücre işaretçileri için boyama hayatta kalma belirlenmesi ve saflık hücrelerin sağlar, ancak sınırlı bilgi kültür dinamikleri üzerinde sağlar. Burada 14 DIV TIC sonra P21 sıçan microglia hızlandırılmış bir film hazırladık. İki hafta sonra serum-Alerjik kültürleri ile hızlı işlem uzantıları ve retractions yemek boyunca dinamik gözetim davranış göstermek ( film 1bakınız). Ayrıca, biz daha önce serum pozlama bunlar devlet özelliklerini microglia, dinlenme dönüşümleri kalıcı morfolojik ve fagositik değişiklikler sonucu bulduk. Biz TIC içinde microglia 5 gündür kültürlü bir film dahil sonra % 10 FCS maruz ( Film 2bakınız).
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov1.jpg"> Film 1: tanımlanan-orta microglia kültürler göstermek ramified Morfoloji dinamik süreçler ile. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 14 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 14 DIV görüntüleri her 3 dakikada toplanmıştır. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşedeki görüntüleme süresini gösterir h:min. içinde film Bohlen ve ark. yeniden oluşturulur 9 ve izni ile kullanılır. Bu videoyu izlemek için <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57122/Movie_1.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov2.jpg"> Movie 2: Serum pozlama tetikler tanımlanan-orta mikroglial kültürlerde hızlı bir morfolojik değişim. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 5 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 5 DIV, görüntüleri her 5 dk. hareketliliği/Morfoloji, sonra 2:55 at (2 saat, 55 dk) kaydedildi temel toplanmıştır, % 50 medya Değiştir % 10 son bir konsantrasyon FCS eklemek gerçekleştirildi. Hücre için bir ek 7 h görüntüsü. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşesinde h:min. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57122/Movie_2.avi" target="_blank">Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen görüntüleme süresini gösterir. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Görüntüleme.  Stanford University. Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Video: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Nörobilim

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

Source: Jebelli, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52983">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

Sıçan Serebellar Granül Nöron Kültüründen Mikroglia'nın Seçici Olarak Çıkarılması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Instruments, ...

Çoklu kültür ve Etkileşim Çalışmaları

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...