Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
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この作品はクリストファーと脊髄損傷、博士ミリアムとシェルドン g. アデルソン医療研究財団、JPB、ノバルティス研究所の基礎研究、ダナ リーブ財団国際研究コンソーシアムによって支持されました。デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (DRG-2125-12) とステラ ・ コーツ、ヴィンセントからの寛大な貢献。

齧歯動物を含むすべてのプロシージャは、国立と州法およびポリシーに準拠したスタンフォード大学のガイドラインに適合。動物のすべてのプロシージャは、スタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルによって承認されました。
注: すべてのソリューションとバッファー組成材料のテーブルで提供されます。
1. 準備ペトリ皿 CD11b Immunopanning (0 日)
注: は、すべての 1-2 の幼若ラット脳の 1 immunopanning 料理を準備します。
<ol><li>15 cm のシャーレに 50 mm Tris pH 9.5 液 25 mL を追加します。</li>
	<li>6 μ G/ml の最終的な集中のための料理にヤギ抗マウス IgG (H + L 鎖) を追加します。均等に板を旋回します。</li>
	<li>37 ° C で 1-3 h の皿を孵化させなさい</li>
	<li>DPBS ++ (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +と Mg2 +) と 3 回リンス料理パン 1 μ G/ml OX42 抗体を含むバッファーのソリューションに置き換えます。平らな面に室温で一晩料理を残します。</li>
</ol>2. 組織コレクション (1 日目)
注: このプロトコルは、3 〜 4 時間を取る必要があります。
<ol><li>始める前に、すべてのソリューションは、滅菌、冷たい氷の上を確認します。氷の上のすべての機器を冷やすし、使用前にエタノールで消毒します。</li>
	<li>次の適切な規制制定手続、二酸化炭素の窒息によって少年の実験用ラットを犠牲に。 注: また、若い動物が犠牲になるケタミン ・ キシラジン (24 mg/mL ケタミン、2.4 mg/mL キシラジンの 100-200 μ L) の致命的な線量を持つ。動物は年齢の 14 日以内である場合、ケタミン ・ キシラジンを使用する必要があります。複数の動物を使用している場合 1 つの動物から組織を抽出し、その後動物に進む前に氷の上あらかじめ冷やした DPBS+ +に配置。</li>
	<li>続行する前に動物から完全な応答がないを確保して、後足をピンチします。</li>
	<li>Transcardially は、10-30 mL の冷たい血流バッファー バッファー クリアを実行するまでに 27 G の針を使用して動物を灌流します。 注: 灌流バッファーの量は、動物のサイズ/年齢によって異なります。</li>
	<li>灌流後すぐに動物の頭を削除します。両側後頭顆を解剖ハサミで切って脊髄から来て、脳を損傷しないように注意します。慎重にそれぞれの側を切り、頭頂に向かって鼻の骨の前面の骨に沿って片側をカットします。鉗子で慎重に頭蓋骨の上部を引いて、すぐに取り外し脳 (または興味の中枢神経系の構造)、中古冷蔵 DPBS+ +に氷の上。</li>
	<li>残りのすべての動物に対して繰り返します。 注: 適切な無菌条件の下で層流フードの手続のすべての手順を実行必要があります。</li>
</ol>3. 機械的解離 (1 日目)
<ol><li>すべての脳が収集された後冷たいメス刃で氷の上のシャーレに 1 mm3チャンクに一つの脳をチョップし、5-7 mL 冷たい douncing バッファーと冷たい dounce ホモジナイザー転送します。一度に 1 つの脳を切り離します。</li>
	<li>ゆったりした dounce ホモジナイザーを用いた 10-20 穏やかで不完全なストロークを使用して組織を切り離して考えます。直接粉砕、ホモジナイザーの下部組織ではなく、代わりにピストンの側面と、ホモジナイザー間の空間を通じて組織をインペル世話をします。</li>
	<li>気泡の導入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。ホモジナイザーの底に沈殿する不十分な解離組織塊を許可し、上清を新しい冷蔵 50 mL コニカル チューブに転送します。</li>
	<li>新鮮な douncing のバッファー、削除されたボリュームに置き換え、3-4 ラウンド、またはすべての組織が関連付けが解除されるまで合計 3.2 と 3.3 の手順を繰り返します。それぞれの脳の手順を繰り返します。</li>
</ol>4. ミエリン除去 (1 日目)
注: ミエリン除去は、ミクログリア P12 より古い動物からの分離に使用されます。
<ol><li>25 mL のピペットを使用して 50 mL コニカル チューブに細胞懸濁液の体積を測定し、33.5 mL に容量を調整する冷たい douncing バッファーを追加します。</li>
	<li>数回チューブの反転によって徹底的に細胞懸濁液とミックスに 10 mL の髄分離バッファー (MSB) を追加します。これは 43.5 mL の容積の MSB の 23% の最終濃度になります。</li>
	<li>ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分の細胞を遠心します。 注: 遠心分離機は、減速する約 1.5-2 分を取る必要があります。これはミエリンと死んだ細胞の残骸、やや濁った上澄み、生きた細胞の濃縮は小さいペレットの上位層が生成されます。</li>
	<li>ミエリン/破片やピペットで上澄みの最上位のレイヤーを削除します。それの多くは可能な限り削除されますを確保するための最上位のレイヤーを削除するとき注意してください。</li>
	<li>バッファーをパンの 12 mL の細胞ペレットを再懸濁します。残っているかもしれない細胞の任意の塊を破るに細胞懸濁液をそっとカップ刻んだ。</li>
</ol>5. Immunopanning (1 日目)
<ol><li>細胞懸濁液の大きい残骸または細胞塊を削除する 70 μ m セル ストレーナーに通過します。</li>
	<li>3 回 DPBS+ +と OX42 コーティングのパン皿をすすいでください。プレートを許可しない洗浄の間完全に乾燥。</li>
	<li>最後の DPBS+ +洗浄を離れて注ぎ、フィルター処理された細胞懸濁液をパン皿に適用します。優しく細胞を配布するプレートを旋回し、付着する細胞を許可する 20 分間室温で平らな面にプレートを孵化させなさい。20 分以上インキュベートはないまたは細胞がお皿から復旧が非常に困難になります。</li>
	<li>非付着性のセルを削除する DPBS+ +とパン皿 10 倍をすすいでください。ミクログリアとなりますので他の非付着性のセルの除去を確保するため各リンス版は渦巻きプレートにしっかりと取り付け。</li>
	<li>最後の DPBS+ +洗浄を離れて注ぎ、15 mL DPBS+ +と 200 μ L トリプシン (1.25% 原液) で置き換えます。</li>
	<li>10% CO2 trypsinize 37 ° C で ≤10 分の皿を孵化させなさい。 注: が 10 分以上続行しないでくださいまたはミクログリアは除去が困難になります。</li>
	<li>Trypsinization の 10 分後に、ミクログリアがプレートにまだ立ち往生しているが。トリプシン/DPBS+ +を注ぎ、水洗いしてトリプシンを削除、冷たいミクログリア培 (MGM) 12 mL に置き換えます DPBS+ +で 2 倍。</li>
	<li>セル/基板相互作用を弱めるし、料理を確認できる場所を 2 分間氷の上の皿をパンはパン皿の分野の乾燥を防ぐためにフラットです。</li>
	<li>積極的のピペット 10 mL ピペット、ピペット コント ローラーと高速パン皿から細胞を回復します。すべてのセルを削除しようとするピペットから液の流れに 16 × 16 のグリッドを描画します。</li>
	<li>細胞をプレートからデタッチを確認する 20 倍の倍率の顕微鏡下の細胞をチェックしてください。細胞がまだ立ち往生している皿の上にスポットをマークとこれらの分野でピペッティング繰り返し。</li>
	<li>細胞懸濁液上清 15 mL の円錐管あたりの分注 3-4 mL を収集します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分間スピンします。 注: セルの最大復旧できます少量によるミクログリアを回転します。</li>
	<li>細胞ペレットに MGM の 0.5 mL を残して上清を吸引します。</li>
	<li>残りの MGM でペレットを再懸濁し、すべての管から細胞のプールします。</li>
	<li>検定でのセルをカウントします。</li>
	<li>手順 6 - アプリケーションに応じて 7 で説明したように細胞をプレート。</li>
	<li>10% の CO2と 37 ° C で培養細胞。 注: 正規メディア変更で最大 3-4 週間またはメディア変更なしで 1 週間の文化は、細胞がすることができます。</li>
</ol>6. スポット コーティング組織培養プレート/Coverslips (1 日目)
<ol><li>24 ウェル アニオン ・ カチオン コート培養皿の中央に直接コラーゲン IV コーティングの 15 μ L をプレート (詳細については材料の表を参照) と 10% の CO2と 37 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>検定とセル数を計数後 MGM の 105/mL × 2.3 に細胞を希釈します。コラーゲン IV スポット、すぐにこの場所; に細胞懸濁液の板 15 μ L を吸引します。これは 10 の3セル/スポット x 3.5 を与えます。井戸の中に優しく付着、500 μ L の CO2 -平衡 TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC) を追加するセルを許可する 10% CO2と 37 ° C で 5-10 分間インキュベートします。</li>
	<li>めっき 10 μ G/ml の策略-D-リジン (PDL) H2O の場合は常温では、1 h での最初のコート滅菌ガラス coverslips coverslips 場合 H2O、3 回を洗浄し、紫外線の下でフードに乾燥させます。Coverslips 乾燥されたら、続行、coverslips スポットめっきステップ 6.2 で説明するよう。</li>
</ol>7. RNA ・ タンパク質分離用めっき
<ol><li>日 1、コート全域、24 ウェル アニオン ・ カチオンのコラーゲン IV コーティングと組織培養プレートのコーティングし 10% CO2、37 ° C で 10 分-1 時間のためのインキュベートを削除し、すぐにプレートの 3 ~ 5 倍の CO2の 10 の4細胞/ウェル平衡TIC メディア。</li>
	<li>2 日目、それぞれの準備の翌日も 50% メディアの変更を実行します。死んだ細胞で、井戸の中心クラスター、だからそこからメディアを取りがちであります。</li>
	<li>文化を維持するために 50% メディア変更ごとに 2-3 日間を実行します。メディアの変更は、文化の不要な変数を導入、細胞は定期的なメンテナンスで 3 週間以上のではなく、メディア変更せず約 1 週間生き残ることができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

ミクログリアは、sentinel 中枢神経系の免疫担当細胞として機能するため、環境の変化に非常に敏感したがって、分離、文化8時に細胞内での炎症反応を最小限に抑えるため細心の注意が必要です。これは、速度と温度をこのプロトコルで実現されます。動物は冷たい血流バッファーと灌流し、組織の間の時間を最小限に抑えるために合理化されましたプロトコルまたは 4 ° C ?...

中枢神経系の柔組織のマクロファージ、ミクログリア神経回路とグリア細胞のシグナリング ネットワークの広大な配列と通信します。彼らは開発およびシナプスの刈り込み、アポトーシス細胞のクリアランスと神経突起1,2で一時的な相互作用を介して脳の恒常性の重要な役割を果たします。ミクログリアは、病変部に炎症性応答を調整し出血の3、4を制限する彼らの長い、細いプロセスを拡張する神経学的な傷害に初期応答です。ミクログリアの形態と機能の変化は、急性および慢性の両方の中枢神経系傷害、ユビキタス、ミクログリア展示変更形態、ローカリゼーション、および多様な疾患状態1中の炎症メディエーターの発現。人間の遺伝学的研究を示す神経変性疾患のための危険を変える突然変異は、病気の発症や進行5 におけるミクログリアの重要な役割を指して、そのまま中枢神経系におけるミクログリアによって表現頻繁に主にまたは専らこと.けがや病気の彼らの卓越性を与えられた、新しい治療上のアプローチを開発するための高い優先度は、ミクログリアの生物学の理解を促進します。
ミクログリアの生物学の理解には多くの重要な進歩はテクニックとメカニズム他マクロファージを培養、遺伝子発現プロファイル、および機能の定義を含む集団の研究で発見された推定することによって生じています。形態/状態。マクロファージ機能しばしば中枢神経系ランドス ケープ内で意外な方法で再生を一般化、ミクログリアは自分自身、専門性の高い、分岐された形態および他の組織から離れてそれらを設定するユニークな遺伝子発現シグネチャを出展マクロファージ6。ミクログリアは他のほとんどのティッシュの大食細胞の異なる系統があります。彼らは原始造血の初期胚性波の中に中枢神経系を植民地化し、自己決定的な造血7からの貢献の独立した、生涯更新します。大人マイクログリアの完全に成熟した遺伝子発現シグネチャは、第 2 の8の生後週まで達成されていません。周囲の組織から環境の手がかりは、組織固有のマクロファージ機能6、中枢神経系血液脳関門9によって与えられた血液媒介要因への限られた露出を含むを口述筆記で主要な役割を果たします。
完全にミクログリアへの中枢神経の恒常性や病気を理解するための 1 つの障害が見られる成熟したミクログリア体内浄化された細胞の特殊なプロパティをさたの難しさ体外。分離する多くの方法が開発されている、文化そのままミクログリアがほとんどアプローチ細胞生存率をサポートするための血清に依存します。生理活性分子の広大な配列を含む本質的に変数の試薬は、ミクログリアの操作それはアメーバの形態を促進するため増加増殖は、特に問題となる、血清を加えている示されていると貪食亢進9は、ミクログリアが血液血液-脳関門の破壊後の要素にさらされる生体内でよく見かけます。これらのメトリックによって血清曝露細胞は、けがや病気の状態、ミクログリアを似ていますが、このような変化を減少しているミクログリアを亜セレン酸、コレステロール、TGF-β 髄液 1 (または IL-34) を含む定義された成長培地で培養すると。
このプロトコルは、最近出版された仕事9に関連する無血清条件下で幼若ラット ミクログリアを培養するための詳細を提供します。このプロトコルは、ラット生後 21-30 (P21 - P30) より合理化されていますが、収量および全体的な生存率は種および動物の年齢によって異なりますがラットおよびあらゆる年齢のマウスのミクログリアの分離に適応することができます。最大利回りし、若干未熟なミクログリアを使用するときに最適な生存を達成 (~ P9)、利回りと徐々 に先を細くやや大人動物の下位レベルの生存率。ミクログリアはマウスから分離することができますが、我々 はラットの細胞を示す有意に高い利回り、実行可能性、および分岐された形態の複雑さ無血清培養マウス細胞と比較して発見しました。動物が P50 より大きい高齢者このプロトコルで評価されていません。この immunopanning の分離のプロシージャは分離中ミクログリア転写プロファイルの変化を最小限にしてセルの下流の可能性を最大化する最適化されています。これらの技術とメディアの製剤を使用して、週間高生存率初代培養を維持できます。これらの条件下で培養したミクログリアは急速な拡張とプロセスの撤回を含む高度分岐し形態を展示し、増殖率が比較的低い。これらのプロパティの血清露出の意義を強調し、他のアプローチと比較してこの方法の長所と短所を話し合います。

<table><tbody><tr><td>Rat: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Goat polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone from milk solids</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plates&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stock reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:25,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oleic acid/Gondoic acid</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 50 &amp;mu;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 200 &amp;mu;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &amp;mu;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &amp;mu;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &amp;mu;g/mL insulin, 100 &amp;mu;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite&lt;br/&gt; Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td></tr><tr><td>Collagen IV Coating</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing 2 &amp;mu;g/mL collagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl2, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl2&lt;br/&gt; Comments: Mix well after the addition of&amp;nbsp; CaCl2 and MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &amp;mu;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &amp;mu;g/mL heparan sulfate, 0.1 &amp;mu;g/ml oleic acid, and 0.001 &amp;mu;g/ml gondoic acid&lt;br/&gt; Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &amp;deg;C and do not add more than 1.5 &amp;mu;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

ミクログリアは、中枢神経系 (CNS) のすべてのセルの 5-10% を表し、開発、恒常性と病の間に彼らの貢献のための注目に高まっています。マクロファージは、数十年、ミクログリアの特殊な機能、中枢神経系の組織に常駐マクロファージの詳細研究されてきたが大きく神秘的な成熟したミクログリアを要約する能力の制限により一部に残っています。文化のプロパティ。ここでは、私たちは成熟した齧歯動物の脳から純粋なミクログリアの急速な隔離のための簡単な手順を示しています。時間をかけてミクログリア生存率の高レベルをサポートする無血清培養条件についても述べる。これら定義培地条件下で培養したミクログリア精巧な区分されたプロセスと動的監視行動を表わします。我々 は議論するどのミクログリアの生体内と同様、両方の文化の血清露出に比較してこれらの無血清培養および培養マイクログリアに及ぼす血清露出を示しています。

このプロトコルは、幼若ラットから文化分岐高純度ミクログリアにメソッドを説明します。同様の結果は、後述するように未熟な周産期および大人の動物を使用して取得できます。細胞分離には微妙なニュアンスや細胞を死の多くの機会があります、ので、さまざまな段階での成功を決定するため品質管理のチェックポイントを使いました。我々 は通常の隔離のプロ...

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Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K ビュー.  Stanford University. ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

免疫・感染学

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

神経科学

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

Source: Jebelli, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52983">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

ラット小脳顆粒ニューロン培養物からのミクログリアの選択的除去

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Instruments, ...

共培養と相互作用の研究

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

要約

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新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

ラット小脳顆粒ニューロン培養物からのミクログリアの選択的除去

無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

要約

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新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

成体マウス脳の皮質からのミクログリアの分離

ラット小脳顆粒ニューロン培養物からのミクログリアの選択的除去

無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離