Diese Arbeit wurde von Christopher und Dana Reeve Foundation International Research Consortium auf Verletzungen des Rückenmarks, Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, der Stiftung JPB Novartis Institute der Grundlagenforschung unterstützt, großzügige Beiträge von Vincent und Stella Coates und Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Alle Verfahren, die Nagetiere entsprach Stanford University Richtlinien, welche nationalen und staatlichen Gesetze und Richtlinien einhalten. Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care stimmten alle tierische Verfahren.
Hinweis: Alle Lösung und Puffer Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
1. bereiten Sie eine Petrischale für CD11b Immunopanning (Tag 0)
Hinweis: Bereiten Sie 1 Immunopanning Gericht für jeden 1-2 juvenile Ratten Gehirne.
<ol><li>Eine 15 cm Petrischale 25 mL 50 mm Tris pH 9.5 Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie Ziege Anti-Maus IgG (H + L-Ketten hinzu), die Schüssel für eine Endkonzentration von 6 µg/mL. Wirbel-Platte zu verteilen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schale für 1-3 h bei 37 ° c</li>
	<li>Spülen Geschirr dreimal mit DPBS++ (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 + und Mg2 +), dann mit einer Lösung aus schwenken Puffer mit 1 µg/mL OX42 Antikörper zu ersetzen. Lassen Sie die Gerichte über Nacht bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche.</li>
</ol>(2) Gewebe Sammlung (Tag 1)
Hinweis: Dieses Protokoll dauert ca. 3-4 h.
<ol><li>Sicherzustellen Sie bevor Sie beginnen, dass alle Lösungen sind steril und gekühlt auf Eis. Entspannen Sie alle Instrumente auf Eis und mit Ethanol vor Gebrauch sterilisieren.</li>
	<li>Nach entsprechenden behördlichen Verfahren Opfere eine juvenile Laborratte durch Kohlendioxid ersticken. Hinweis: Alternativ können jüngere Tiere mit einer letalen Dosis von Ketamin/Xylazin (100-200 µL 24 mg/mL Ketamin, 2,4 mg/mL Xylazin) geopfert werden. Ketamin/Xylazin muss verwendet werden, wenn Tiere weniger als 14 Tage alt sind. Wenn mehrere Tiere zu verwenden, extrahieren Sie das Gewebe von einem Tier zu und in vorgekühlt DPBS++ auf dem Eis vor der nachfolgenden Tiere.</li>
	<li>Klemmen Sie ein Hindpaw und sorgen für komplette Teilnahmslosigkeit des Tieres, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Transcardially Durchspülen des Tieres mit 10-30 mL eiskaltes Perfusion Puffer mit einer 27½-G-Nadel bis Puffer klar ist. Hinweis: Volumen der Perfusion Puffer variiert je nach Größe/Alter des Tieres.</li>
	<li>Entfernen Sie sofort nach der Perfusion der Kopf des Tieres. Aus das Rückenmark der occipital-Kondylus auf jeder Seite mit Dissektion Schere schneiden, achten Sie darauf, das Gehirn schädigen. Nach dem Schneiden Schneiden jeder Seite sorgfältig, einseitig entlang der parietalen und Stirnbein auf dem Nasenbein. Mit einer Pinzette vorsichtig zurückziehen Sie der Spitze des Schädels, schnell entfernen Sie das Gehirn (oder CNS Strukturen von Interesse), und in vorgekühlt DPBS++ auf Eis.</li>
	<li>Wiederholen Sie für alle verbleibenden Tiere. Hinweis: Alle Schritte des Verfahrens sollte in einem Laminar-Flow-Abzug unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
</ol>3. mechanische Dissoziation (Tag 1)
<ol><li>Nachdem alle Gehirne gesammelt haben, ein Gehirn in 1 mm3 Stücke in einer Petrischale auf Eis mit einem kalten Skalpellklinge hacken und transfer zum einen eiskalten Dounce-Homogenisator mit ca. 5-7 mL eiskaltes Douncing Puffer. Ein Gehirn zu einem Zeitpunkt zu distanzieren.</li>
	<li>Distanzieren Sie das Gewebe mit 10-20 sanft und unvollständige Strichen mit eine locker sitzende Dounce-Homogenisator. Achten Sie darauf, nicht direkt das Gewebe am unteren Rand der Homogenisator zu zerquetschen, aber stattdessen drängen des Gewebes durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und der Homogenisator.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Kolben um Einführung von Luftblasen zu verhindern. Können Sie schlecht dissoziierten Gewebe Stücke sich am unteren Rand der Homogenisator und übertragen Sie überstand auf eine neue gekühlte 50 mL konische Rohr.</li>
	<li>Ersetzen Sie den entfernten Datenträger mit frischen Douncing Puffer, und wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für eine Gesamtmenge von ca. 3-4 Runden oder bis alle Gewebe getrennt worden. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gehirn.</li>
</ol>4. Myelin Entfernung (Tag 1)
Hinweis: Myelin Abbau dient zur Isolierung der Mikroglia von Tieren, die älter als P12.
<ol><li>Messen Sie das Volumen der Zellsuspension in der 50 mL konische Röhre mit einer 25 mL-Pipette, dann fügen Sie eiskalte Douncing Puffer, um das Gesamtvolumen auf 33,5 mL einstellen.</li>
	<li>10 mL Myelin Trennung Puffer (MSB) am Zellsuspension und fügen Sie Mischung gründlich durch Umdrehen der Röhre mehrere Male hinzu. Dadurch wird eine 23 % Endkonzentration von MSB in einem Volumen von 43,5 mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellen für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen. Hinweis: Die Zentrifuge dauert ca. 1,5-2 min zu verlangsamen. Dies generiert eine obere Schicht von Myelin und tote Zelle Schutt, einen etwas düsteren überstand und eine kleinere Pellets, die für lebende Zellen angereichert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere Schicht des Myelin/Schutt und der Überstand mit einer Pipette. Vorsicht beim Entfernen der obersten Schicht sicherzustellen, wie viele davon wie möglich entfernt wird.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 12 mL Puffer schwenken. Genannte sanft die Zellsuspension zu brechen Klumpen von Zellen, die bleiben könnte.</li>
</ol>5. Immunopanning (Tag 1)
<ol><li>Durchlaufen Sie die Zellsuspension ein 70 µm Zelle Sieb, großen Trümmer oder Zelle Klumpen zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie die OX42-beschichtete panning Schale dreimal mit DPBS++. Lassen Sie nicht die Platte trocken zwischen den Waschgängen.</li>
	<li>Die letzten DPBS++ waschen abgießen und panning Gericht die gefilterte Zellsuspension zuweisen. Vorsichtig schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu verteilen, dann inkubieren Sie die Platte auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur für 20 min damit Zellen halten. Nicht länger als 20 min inkubieren oder Zellen werden sehr schwierig, aus der Schale zu erholen.</li>
	<li>Spülen Sie das panning Gericht mit DPBS++ 10 Mal, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, so schwenken Sie die Platte mit jedem abspülen, um sicherzustellen, dass andere nicht anhaftende Zellen entfernt.</li>
	<li>Gießen Sie die letzten DPBS++ waschen und ersetzen durch DPBS++ 15 mL und 200 μL Trypsin (1,25 % Stammlösung).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schüssel für ≤10 min bei 37 ° C mit 10 % CO2 zu trypsinize. Hinweis: Nicht länger als 10 min weiter oder Mikroglia wird nur schwer zu entfernen.</li>
	<li>Nach 10 min Trypsinization wird die Mikroglia noch auf Platte geklebt werden. Trypsin/DPBS++ Gießen Sie ab und waschen Sie vorsichtig 2 X mit DPBS++ Trypsin zu entfernen, ersetzen mit 12 mL eiskaltes Mikroglia Wachstumsmedium (MGM).</li>
	<li>Ort schwenken Gericht für 2 min auf Eis zur Zelle/Substrat Interaktion zu schwächen, und sicherstellen, dass die Schale ist flach bis Bereiche der Schwenk Schale Austrocknen verhindert wird.</li>
	<li>Pipette kräftig mit einem 10 mL Pipette und Pipettieren Controller auf high-Speed Zellen aus der Schwenk Schale wiederherstellen. Zeichnen Sie ein 16 x 16-Gitter mit dem Strom der Flüssigkeit aus der Pipette zu versuchen, und entfernen alle Zellen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 20 X Vergrößerung, um sicherzustellen, dass Zellen von Platte losgelöst haben. Mark-Flecken auf der Schale, wo Zellen sind immer noch fest, und wiederholen Sie in diesen Bereichen pipettieren.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension und aliquoten 3-4 mL überstand pro 15 mL konische Röhrchen. Spinnen Sie für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen. Hinweis: Spinning Mikroglia durch ein kleines Volumen ermöglicht die maximale Regeneration der Zellen.</li>
	<li>Aspirieren des Überstands, 0,5 mL von MGM mit der Pellet-Zelle zu verlassen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie jedes Pellet im übrigen MGM und bündeln Sie die Zellen von den Schläuchen.</li>
	<li>Anzahl Zellen mit Hemocytometer.</li>
	<li>Platte Zellen wie in Schritt 6 - 7 je nach Anwendung beschrieben.</li>
	<li>Zellkulturen bei 37 ° C mit 10 % CO2. Hinweis: Zellen können für bis zu 3-4 Wochen mit regelmäßigen Medien Änderungen oder eine Woche mit unveränderten Medien Kultur sein.</li>
</ol>6. Ort Beschichtung Gewebekultur Platten/Deckgläsern (Tag 1)
<ol><li>Platte 15 µL Kollagen IV Beschichtung direkt in der Mitte einer 24-Well anionischen/kationischen beschichtete Gewebe-Kultur-Platte (siehe Tabelle der Materialien für Details) und inkubieren Sie für 15 min bei 37 ° C mit 10 % CO2.</li>
	<li>Nach dem zählen von Zellen mit Hemocytometer verdünnen Sie Zellen auf 2,3 x 105/mL im MGM. Aspirieren Sie Kollagen IV-Stelle und sofort Platte 15 µL Zellsuspension zu dieser Stelle; Dadurch erhalten 3,5 x 103 Zellen/Spot. 5-10 min bei 37 ° C mit 10 % CO2 erlauben Zellen zu halten, fügen Sie 500 µL der CO2 -TGF-β2/IL-34/Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium (TIC) equilibriert inkubieren Sie sanft zum Brunnen.</li>
	<li>Wenn auf Deckgläsern, erste Mantel sterile Glasdeckgläser mit 10 µg/mL Trick-D-Lysin (PDL) in H2O 1 h bei RT, Beschichtung mit H2O 3 Mal waschen und trocknen in eine Haube unter UV-Licht. Sobald Deckgläsern trocken sind, fahren Sie mit vor Ort-Beschichtung auf den Deckgläsern, wie in Schritt 6.2 beschrieben.</li>
</ol>(7) Überzug für RNS/Protein isoliert
<ol><li>Am Tag 1, Mantel, das gesamte Gebiet von einer 24-Well anionischen/kationischen Gewebekultur Platte mit Kollagen IV Beschichtung beschichtet und inkubieren Sie für 10 min - 1 h bei 37 ° C mit 10 % CO2, dann entfernen und sofort Platte 3-5 x, equilibriert 104 Zellen/Brunnen in CO2 TIC-Medien.</li>
	<li>Am 2. Tag führen Sie ein Medienwechsel von 50 % für jede gut am Tag nach der Zubereitung. Abgestorbenen Zellen neigen dazu, in der Mitte des Brunnens cluster, so nehmen Medien von dort.</li>
	<li>Führen Sie eine 50 % Medienwechsel alle 2-3 Tage um die Kulturen zu erhalten. Wenn Medien Änderungen eine unerwünschte Variable für die Kulturen einführen, können Zellen für ca. 1 Woche ohne Medien Änderungen, im Gegensatz zu über 3 Wochen bei regelmäßiger Wartung überleben.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Da Mikroglia als Sentinel immunen Zellen des ZNS dienen, sind sie sehr ansprechend auf Veränderungen der Umwelt; Daher ist großer Sorgfalt erforderlich, um entzündliche Reaktionen in den Zellen während ihrer Isolation und Kultur8zu minimieren. Dies geschieht in diesem Protokoll durch Geschwindigkeit und Temperatur. Die Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten, wann immer möglich Aktivierung, reduziert so dass alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C erfolgen, die Tiere sind mit eiskalten P...

Als Makrophagen CNS Parenchym Mikroglia interagieren mit einer Vielzahl von neuronalen Schaltkreise und Glia Signalisierung Netzwerke. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Homöostase des Gehirns durch synaptische Rebschnitt, apoptotische Zelle Abfertigung und transiente Interaktionen mit neuronalen Prozessen1,2. Mikroglia sind frühe Responder zu neurologischen Verletzungen, erweitern ihre langen, dünnen Prozesse Läsionsorte zu Entzündungsreaktionen zu koordinieren und Blutungen3,4zu begrenzen. Veränderungen in der Mikroglia Morphologie und Funktion sind allgegenwärtig in akuten und chronischen Verletzungen der CNS und Mikroglia Ausstellung verändert, Morphologie, Lokalisierung und Ausdruck von Entzündungsmediatoren in einem breiten Spektrum von Krankheit Staaten1. Menschliche genetische Studien zeigen, dass Mutationen, die Gefahr für Neurodegenerative Erkrankungen verändern oft überwiegend oder ausschließlich von Mikroglia im intakten ZNS, Hinweis auf eine entscheidende Rolle für die Mikroglia in der Pathogenese der Krankheit oder das Fortschreiten5 ausgedrückt werden . Da ihre Prominenz bei Verletzungen und Krankheit, ist fördern das Verständnis der Mikroglia Biologie einen hohen Stellenwert für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.
Viele wichtige Fortschritte für das Verständnis der Mikroglia Biologie entstanden durch Extrapolation Techniken und Mechanismen, die in Studien von anderen Makrophagen Populationen einschließlich Kulturmethoden, gen Expressionsprofile und Definition der funktionalen entdeckt / morphologischen Staaten. Obwohl generalisiert Makrophagen Funktionen oft auf überraschende Weise in der CNS-Landschaft spielen, Mikroglia selbst sind hochspezialisiert, ausstellenden eine verzweigte Morphologie und eine einzigartige gen Ausdruck Signatur, die sie von anderem Gewebe unterscheidet Makrophagen-6. Mikroglia haben eine Linie, die sich von den meisten anderen Gewebe Makrophagen unterscheidet; Sie besiedeln die CNS während einer frühen embryonalen Welle der primitiven Hämatopoese und selbst im gesamten Leben, unabhängig von der definitiven Hämatopoese7Beiträge zu erneuern. Die vollreifen gen Ausdruck Unterschrift des Erwachsenen Mikroglia wird nicht bis die zweite postnatalen Woche8erreicht. Ökologische Hinweise aus dem umliegenden Gewebe Rolle diktieren gewebespezifischen Makrophagen Funktionen6, die im ZNS beschränkt Belastung durch Blut übertragbare Faktoren gewährt durch die Blut - Hirn-Schranke9beinhaltet eine wichtige.
Ein Hindernis für die Mikroglia Beiträge zu CNS-Homöostase und Krankheit vollständig zu verstehen ist die Schwierigkeit, die speziellen Eigenschaften der Reifen Mikroglia gesehen in Vivo mit gereinigten Zellen Rekapitulation in-vitro-. Viele Methoden wurden entwickelt, um zu isolieren und Kultur intakt Mikroglia, aber die meisten Ansätze setzen auf Serum, Überleben der Zellen zu unterstützen. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum, das ist ein von Natur aus Variable Reagenz enthält eine breite Palette von bioaktiven Moleküle, ist besonders problematisch, wenn arbeiten mit Mikroglia weil es eine amöboiden Morphologie fördert Verbreitung erhöht, und erhöhte Phagozytose9 oft gesehen in Vivo bei Mikroglia blutübertragbaren Faktoren nach der Unterbrechung der Blut - Hirn-Schranke ausgesetzt sind. Durch diese Metrik Serum-exponierten Zellen Microglia Verletzungen oder Krankheiten ähneln, aber derartige Veränderungen reduziert wenn Mikroglia in definierten Wachstumsmedium mit CSF-1 (oder IL-34), TGF-β, Cholesterin und Selenit kultiviert werden.
Dieses Protokoll enthält Details zur Kultivierung juvenile Ratte Mikroglia unter serumfreien Bedingungen im Zusammenhang mit kürzlich veröffentlichtes Werk9. Dieses Protokoll wurde für Ratten von postnatale Tag 21-30 (P21 - P30) gestrafft, aber an Microglia von Ratten und Mäusen jeden Alters isolieren angepasst werden kann, obwohl der Ertrag und die gesamte Tragfähigkeit abhängig von der Art und dem Alter des Tieres variiert. Maximale Erträge und optimale Rentabilität ist erreicht, wenn etwas unreif Mikroglia verwenden (~ P9), mit Erträgen und Lebensfähigkeit allmählich verjüngt sich zu etwas niedrigere Ebenen bei erwachsenen Tieren. Mikroglia kann auch von Mäusen isoliert sein, aber wir haben festgestellt, dass die Rattenzellen deutlich höhere Erträge, Rentabilität und Komplexität der verzweigten Morphologien, zeigen im Vergleich zu Mauszellen in serumfreien Kulturen. Tiere im Alter von mehr als P50 mit diesem Protokoll nicht ausgewertet wurden. Dieses Immunopanning-Isolierung-Verfahren wurde optimiert, um Veränderungen der Mikroglia transcriptional Profile bei Isolierung zu minimieren und nachgelagerten Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Mit diesen Techniken und Medien Formulierungen, können hohe Rentabilität Primärkulturen wochenlang aufrecht erhalten werden. Unter diesen Bedingungen kultiviert Mikroglia weisen eine stark verzweigte Morphologie mit schnellen ein- und Ausfahren der Prozesse und relativ niedrige Rate der Verbreitung. Wir unterstreichen die Bedeutung der Serum-Exposition auf diese Eigenschaften und stärken und Schwächen dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen zu diskutieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Mikroglia repräsentieren ca. 5-10 % aller Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und sind immer mehr Aufmerksamkeit durch ihre Beiträge während der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Obwohl Makrophagen im Detail für Jahrzehnte, spezielle Funktionen der Mikroglia, die Gewebe-Bewohner Makrophagen des ZNS untersucht wurden, blieben weitgehend geheimnisvoll, teilweise aufgrund von Einschränkungen in der Fähigkeit, Reife Mikroglia rekapitulieren Unterkünfte in Kultur. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die schnelle Lokalisierung der reinen Mikroglia aus dem Reifen Nagetier Gehirn. Wir beschreiben auch serumfreien Kulturbedingungen, die hohe Rentabilität der Mikroglia im Laufe der Zeit unterstützen. Mikroglia, die unter diesen Bedingungen definiert-Medium kultiviert weisen aufwändige verzweigte Prozesse und dynamische Überwachung Verhalten. Wir veranschaulichen einige Auswirkungen der Serum-Exposition auf kultivierten Mikroglia und besprechen, wie diese serumfreien Kulturen im Vergleich zu Serum-exponierten Kulturen sowie Mikroglia in Vivo.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultur hochreine verzweigt Mikroglia von jungen Ratten. Ähnliche Ergebnisse können mit unreifen, perinatale und Erwachsene Tiere, wie weiter unten besprochen. Da Zelle Isolationen oft beinhalten subtilen Nuancen und viele Möglichkeiten für Zellen sterben verwendet wir Qualitätskontrolle Kontrollpunkte um Erfolg in verschiedenen Schritten zu ermitteln. Wir überwacht in der Regel Zellsuspensionen mit einer Hemocytometer in mehreren Schritte...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Aufrufe.  Stanford University. Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Serie: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

Dynamische Quantitative Sensory Testing zu Charakterisieren zentralen Schmerzverarbeitung

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...