Name: isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי כריסטופר דנה ריב קרן קונסורציום בינלאומי מחקר על פגיעה בחוט השדרה, ד"ר מרים, שלדון ג' אדלסון קרן למחקר רפואי, קרן JPB, נוברטיס המכון של מחקר בסיסי, תרומה נדיבה של וינסנט וקוטס סטלה, את דיימון ראניון מחקר קרן סרטן (DRG-2125-12).

בכל ההליכים הכרוכים מכרסמים תאמו הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, העומדים בתקני הלאומי ואת חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך.
הערה: כל פתרון, מאגר של יצירות הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים.
1. מכינים את צלחת פטרי עבור CD11b Immunopanning (יום 0)
הערה: להכין תבשיל immunopanning 1 המוח עכברוש ילדותי כל 1-2.
<ol><li>להוסיף מ 25 ל 50 מ"מ טריס pH 9.5 פתרון צלחת פטרי 15 ס מ.</li>
	<li>להוסיף עז העכבר אנטי איג (H + L שרשראות) המנה עבור ריכוז סופי של 6 µg/mL. מערבולת צלחת לפיזור אחיד.</li>
	<li>דגירה המנה עבור 1-3 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף כלים שלוש פעמים עם DPBS++ (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca2 + ו- Mg2 +), לאחר מכן להחליף עם פתרון של גלילה רציפה מאגר המכיל 1 µg/mL נוגדן OX42. תשאירי את הכלים ללילה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח.</li>
</ol>2. רקמת אוסף (יום 1)
הערה: פרוטוקול זה צריך לקחת ~ 3-4 שעות.
<ol><li>לפני שאתחיל להבטיח שכל הפתרונות הם וסטרילי, צונן על קרח. להירגע כל הכלים על הקרח ולחטא עם אתנול לפני השימוש.</li>
	<li>הפרוצדורות הבאות הרגולציה המתאימה, להקריב עכברוש מעבדה לנוער בעזרת פחמן דו-חמצני. הערה: לחלופין, חיים צעירים עלול להיות קורבן עם מנה קטלנית של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (100-200 µL של קטמין 24 מ"ג/מ"ל, חריגות השירותים הווטרינריים 2.4 mg/mL). קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים חייב לשמש אם בעלי החיים בגיל פחות מ- 14 ימים. אם משתמשים מרובים בעלי חיים, לחלץ את הרקמה חיה אחת והנח אותו לתוך צונן מראש DPBS++ על הקרח לפני שתמשיך לבעלי עוקבות.</li>
	<li>לצבוט hindpaw ולהבטיח את בעיית חוסר מוחלט מן החיה לפני שתמשיך.</li>
	<li>Transcardially perfuse החיה עם 10-30 מ של המאגר הקר זלוף באמצעות מחט 27½-G עד מאגר רץ ברורה. הערה: נפח של מאגר זלוף משתנה בהתאם הגודל/גיל של החיה.</li>
	<li>מיד לאחר זלוף להסיר את הראש של החיה. . מגיעים חוט השדרה לחתוך בעצם העורפית בכל צד עם מספריים לנתיחה, יש להיזהר לא נזק למוח. לאחר חיתוך צד לחתוך בזהירות, צד אחד לאורך דופן בקיבה, עצם המצח לכיוון עצם האף. עם מלקחיים בקפידה לסגת העליון של הגולגולת במהירות להסיר את המוח (או מבנים CNS עניין), מניחים מראש צוננת DPBS++ על הקרח.</li>
	<li>חזור על כל בעלי החיים הנותרים. הערה: כל השלבים בהליך צריכה להתבצע בתוך תא למינארי בתנאים סטריליים ראויים.</li>
</ol>3. מכני דיסוציאציה (יום 1)
<ol><li>לאחר שנאסף כל המוח, קוצצים מח אחד לתוך 1 מ3 נתחים בצלחת פטרי על הקרח עם להב קר אזמל ולאחר להעביר מהמגן דאונס קר כקרח עם המאגר הקר douncing 5-7 מ. מביצועם מח אחד בכל פעם.</li>
	<li>מביצועם הרקמה באמצעות קווים עדינים ולא שלמים 10-20 עם מהמגן דאונס רופפים. הקפידו לא ישירות למחוץ את הרקמה בתחתית מהמגן, אך במקום זאת מאלצים את הרקמות בחלל בין צידי הבוכנה מהמגן.</li>
	<li>הסר בזהירות את הבוכנה כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר. לאפשר הפומבית לקוי רקמת נתחים להתיישב לתחתית מהמגן, להעביר את תגובת שיקוע צוננת 50-mL חרוט צינור.</li>
	<li>החלף את אמצעי האחסון שהוסר מאגר douncing טריים, וחזור על הצעדים 3.2 ו- 3.3 עבור סכום כולל של 3-4 סיבובים, או עד רקמות כל חלופה מועדפת. חזור על התהליך עבור כל המוח.</li>
</ol>4. מיאלין להסרת (יום 1)
הערה: הסרת המיאלין משמש עבור בידוד של מיקרוגלייה מחיות שגילם P12.
<ol><li>למדוד את עוצמת הקול של התליה תא בצינור חרוט 50-mL באמצעות פיפטה 25 מ ל ולאחר מכן להוסיף מאגר douncing קר כקרח כדי לכוונן את העוצמה הכוללת 33.5 מ.</li>
	<li>להוסיף 10 מ ל מאגר ההפרדה מיאלין (MSB) תא ההשעיה, לערבב ביסודיות על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. התוצאה תהיה 23% הסופי ריכוז MSB באמצעי אחסון של 43.5 מ.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי. הערה: לצנטריפוגה צריך לקחת כ- 1.5-2 דקות כדי להאט. פעולה זו תיצור רובד גבוה של מיאלין, שאריות תאים מתים, תגובת שיקוע מנוסתם של גלולה קטנה יותר זה מועשר עבור תאים חיים.</li>
	<li>להסיר את השכבה העליונה של המיאלין/פסולת, את תגובת שיקוע עם פיפטה. יש להיזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח הרבה ממנו הוסר ככל האפשר.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 12 מ של מאגר גלילה רציפה. בעדינות triturate התליה תא כדי לשבור את כל גושים של תאים שאולי נותרו.</li>
</ol>5. Immunopanning (יום 1)
<ol><li>עוברים התליה תא מסננת תא 70-מיקרומטר להסרת פסולת גדולה או תא גושים.</li>
	<li>יש לשטוף את הצלחת השתוותם מצופים OX42 שלוש פעמים עם DPBS++. אל תאפשר את הצלחת עד יבש לחלוטין בין שוטף.</li>
	<li>יוצקים את כביסה DPBS++ האחרון ולהחיל התליה תא מסוננים השתוותם למנה. בעדינות מערבולת את הצלחת להפיץ את התאים ולאחר מכן דגירה את הצלחת על משטח שטוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לאפשר תאים לדבוק. דגירה לא יותר מ 20 דקות או תאים יהיה קשה מאוד לשחזר המנה.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת פנורמית עם DPBS++ 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם מחסידי. מיקרוגלייה יהיה מחובר היטב לצלחת, אז מערבולת לצלחת עם כל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים שאינם מחסידי אחרים.</li>
	<li>יוצקים את כביסה DPBS++ האחרון והחלף 15 מ"ל DPBS++ וμl 200 טריפסין (פתרון 1.25% מניות).</li>
	<li>דגירה המנה ≤10 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2 כדי trypsinize. הערה: אל תמשיך יותר מ 10 דקות או מיקרוגלייה יהפוך קשה להסיר.</li>
	<li>לאחר 10 דקות של trypsinization, עדיין יהיה תקוע מיקרוגלייה לצלחת. יוצקים את טריפסין/DPBS++ ולשטוף בעדינות 2 x עם DPBS++ כדי להסיר טריפסין, החלף 12 מ של מדיום הגידול מיקרוגלייה כקרח (MGM).</li>
	<li>המקום panning המנה בקירור למשך 2 דקות כדי לעזור להחליש את המצע תא/אינטראקציה, וודא כי המנה הוא שטוח כדי למנוע תחומי המנה השתוותם מתייבשת.</li>
	<li>פיפטה נמרצות עם 10-mL פיפטה, pipet בקר על מהירות גבוהה להתאושש תאים המנה פנורמית. שואבים רשת 16 x 16 עם הזרם של נוזל פיפטה ואנסה להסיר כל התאים.</li>
	<li>בדוק תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 20 כדי לוודא תאים יש מנותקת צלחת. מארק כתמים על המנה שבו תאים עדיין תקוע, אני חוזר pipetting באזורים אלו.</li>
	<li>לאסוף את ההשעיה תא aliquot מ ל 3-4 של תגובת שיקוע למחזור חרוט 15-mL. ספין למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי. הערה: ספינינג מיקרוגלייה דרך אמצעי אחסון קטן מאפשר התאוששות מקסימלית של תאים.</li>
	<li>תשאף את תגובת שיקוע, עוזב 0.5 מ של MGM עם בגדר תא.</li>
	<li>Resuspend כל גלולה ב- MGM הנותרים, בריכה תאים מן כל הקברים.</li>
	<li>ספירת תאים עם hemocytometer.</li>
	<li>צלחת תאים כפי שמתואר שלבים 6 - 7 בהתאם ליישום.</li>
	<li>התרבות תאים ב 37 ° C עם 10% CO2. הערה: תאים יכול להיות תרבות עד 3-4 שבועות עם שינויים מדיה רגיל או שבוע אחד ללא שינויים מדיה.</li>
</ol>6. במקום ציפוי תרביות רקמה צלחות/Coverslips (יום 1)
<ol><li>צלחת 15 µL של קולגן הרביעי ציפוי ישירות במרכז צלחת 24-טוב anionic/cationic תרביות רקמה מצופה (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) דגירה למשך 15 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2.</li>
	<li>לאחר ספירת תאים עם hemocytometer לדלל לתאים 2.3 x 10 /mL5ב- MGM. האחות קולגן הרביעי במקום, מיד צלחת 15 µL תא השעיה במקום הזה; זה ייתן 3.5 x 103 תאים/נקודה. תקופת דגירה של 5-10 דקות ב 37 ° C ב- 10% CO2 כדי לאפשר תאים לדבוק, להוסיף 500 µL של CO2 -equilibrated TGF-β2/IL-34/כולסטרול המכילים מדיום הגידול (טיק) בעדינות אל הבאר.</li>
	<li>אם ציפוי על coverslips, הראשון המעיל סטרילי coverslips זכוכית דקה עם 10 µg/mL ploy-D-ליזין (PDL) H2O עבור h 1-RT, לשטוף 3 פעמים עם H2O, ותנו יבש בשכונה תחת אור UV. לאחר coverslips יבש, להמשיך עם ציפוי ספוט על coverslips כמתואר ב- 6.2 שלב.</li>
</ol>7. ציפוי לבידוד RNA/חלבון
<ol><li>יום 1, המעיל כל שטח 24-טוב anionic/cationic מצופה תרביות רקמה צלחת עם ציפוי הרביעי קולגן, דגירה במשך 10 דקות - 1 h ב 37 ° C ב- 10% CO2, ולאחר מכן להסיר, מיד צלחת 3-5 x 104 תאים/טוב CO2 equilibrated טיק מדיה.</li>
	<li>יום 2, לבצע שינוי מדיה 50% עבור כל טוב יום אחרי ההכנה. תאים מתים נוטים אשכול במרכז של הבאר, אז קחו מדיה משם.</li>
	<li>לבצע שינוי 50% מדיה כל 2-3 ימים כדי לשמור על התרבויות. אם שינויים מדיה אציג משתנה לא רצויות על התרבויות, תאים יכולים לשרוד במשך כ שבוע ללא שינויים מדיה, לעומת מעל 3 שבועות עם תחזוקה שוטפת.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li><li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity.">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li><li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier.">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li><li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides.">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages.">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486 (2015).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System.">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.

כיוון מיקרוגלייה לשמש תאים חיסוניים הפלאג של מערכת העצבים, הן מאוד קשוב לשינויים סביבתיים; לכן, זהירות רבה נדרשת כדי למזער את תגובות דלקתיות בתוך התאים במהלך הבידוד שלהם ואת התרבות8. זו מושגת ב פרוטוקול זה דרך טמפרטורה ומהירות. שמירה על התאים על קרח או ב 4 ° C בכל האפשר מקטינה בא?...

כמו מקרופאגים של CNS parenchyma, מיקרוגלייה לקיים אינטראקציה עם מגוון רחב של מעגלים עצביים ורשתות איתות גליה. הם ממלאים תפקיד חיוני בתחום הפיתוח הומאוסטזיס של המוח באמצעות גיזום סינפטית, סיווג תא אפופטוטיים להיפגע, ארעית אינטראקציות עם תהליכים עצביים1,2. מיקרוגלייה הם המגיבים מוקדם כדי מפציעות נוירולוגיים, הרחבת תהליכי שלהם ארוך, דק לאתרים הנגע לתאם תגובות דלקתיות ולהגביל המדמם3,4. שינויים microglial מורפולוגיה ומתפקדים בכל מקום פציעות CNS אקוטי וכרוני, נספח מיקרוגלייה שינו מורפולוגיה, לוקליזציה, ביטוי של מתווכים דלקתיים ב מגוון רחב של מחלות הברית1. מחקרים גנטיים בבני אדם מציינים כי מוטציות שמשנות סיכון למחלות ניווניות בעיקר לעיתים קרובות או באופן בלעדי מבוטאים על-ידי מיקרוגלייה ב מערכת העצבים ללא פגע, הצבעה על תפקיד קריטי עבור מיקרוגלייה בפתוגנזה של המחלה או התקדמות5 . בהתחשב שהמוניטין שלהם, פציעות ומחלות, בהבנה של ביולוגיה microglial הוא בעדיפות גבוהה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות.
רבים ההתקדמות קריטית להבנת הביולוגיה microglial נרקמו על ידי חיוץ שיטות ומנגנונים שהתגלו במחקרים של אוכלוסיות אחרות מקרופאג כולל שיטות, ביטוי גנים פרופילים של הגדרות של פונקציונלי / מורפולוגי של הברית. למרות מוכללת מקרופאג פונקציות לעתים קרובות לשחק בדרכים מפתיעות בתוך נוף CNS, מיקרוגלייה הם עצמם מאוד מיוחדים, מפגין חתימה ביטוי גנים ייחודיים המציבה אותם מלבד רקמות אחרות ומורפולוגיה כחוד מקרופאגים6. מיקרוגלייה יש שושלת זו נבדלת מקרופאגים רקמות ביותר אחרים; לישוב מערכת העצבים במהלך גל עובריים של hematopoiesis פרימיטיבית, מוקדם והם לחדש עצמי לאורך החיים, עצמאית התרומות סופית hematopoiesis7. החתימה ביטוי גנים לבגרות מלאה של מיקרוגלייה למבוגרים לא מושגת עד שבוע לאחר הלידה השניה8. רמזים סביבתיים מן הרקמה שמסביב לשחק תפקיד מרכזי הכתבת רקמות ספציפיות מקרופאג תכונות6, הכולל ב מערכת העצבים חשיפה מוגבלת נישא בדם גורמים שהעניק את מחסום הדם - מוח9.
מכשול אחד להבנת באופן מלא microglial תרומות CNS הומאוסטזיס ומחלות הוא הקושי של recapitulating מאפיינים מיוחדים של בוגרת מיקרוגלייה ראיתי ויוו עם תאים מטוהרים במבחנה. שיטות רבות פותחו כדי לבודד, תרבות מיקרוגלייה ללא פגע, אבל רוב הגישות להסתמך על סרום כדי לתמוך הישרדות cell. הראינו כי תוספת של סרום, אשר הוא ריאגנט מטבעו משתנה המכיל מגוון רחב של מולקולות ביו, בעייתית במיוחד כאשר עבודה עם מיקרוגלייה כי הוא מקדם של מורפולוגיה amoeboid, גדל התפשטות, ו phagocytosis מוגברת9 הנצפה לעתים קרובות vivo כאשר מיקרוגלייה נחשפים דם נישא גורמים לאחר ערעור מחסום הדם - מוח. על ידי מדדים אלה, תאים החשופים הנסיוב דומה מיקרוגלייה פציעה או מחלה, אבל שינויים כאלה מופחתים מתי מיקרוגלייה מתורבתים מדיום הגידול מוגדרים המכילים נוזל מוחי-שדרתי-1 (או איל-34), TGF-β, כולסטרול ו הסלנייט.
פרוטוקול זה מספק פרטים culturing עכברוש לנוער מיקרוגלייה בתנאים ללא סרום, הקשורים בעבודה שפורסם לאחרונה9. פרוטוקול זה התייעלה עבור חולדות מיום כמחנכת 21-30 (P21 - P30), אך ניתן להתאים כדי לבודד מיקרוגלייה של חולדות ועכברים בכל גיל, למרות התשואה ואת הכדאיות הכוללת ישתנו בהתאם מינים של גיל של החיה. התשואות מקסימלי ואת הכדאיות המיטבית מושגת כאשר משתמשים מעט ילדותית מיקרוגלייה (~ P9), עם תשואות הכדאיות בהדרגה אובליסק במידת מה רמות נמוכות יותר בבעלי חיים למבוגרים. מיקרוגלייה ניתן גם מבודד מן העכברים, אבל מצאנו כי תאים עכברוש להראות גבוה משמעותית בתשואות, הכדאיות ומורכבות של כחוד מורפולוגיות, בהשוואה לתאים העכבר בתרבויות ללא סרום. בעלי חיים בגיל גדול יותר P50 לא הוערכו עם פרוטוקול זה. הליך בידוד immunopanning מוטבה כדי למזער את השינויים בפרופילי תעתיק microglial במהלך בידוד, כדי למקסם את הכדאיות במורד הזרם של התאים. באמצעות טכניקות אלה ניסוחים מדיה, גבוהה-יכולת הקיום העיקרי תרבויות יכול להתקיים במשך שבועות. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה שהפגינו מורפולוגיה כחוד מאוד מעורבים הרחבה מהירה ו הכחשה של תהליכים, נמוכה יחסית המחירים של התפשטות. להדגיש את חשיבות סרום-חשיפה על מאפיינים אלה, ואנו נדבר על נקודות החוזק והחולשה של שיטה זו ביחס גישות אחרות.

<table><tbody><tr><td>Rat: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Goat polycolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Staining: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen Laboratory Supplies</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone from milk solids</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&amp;nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plates&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stock reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:25,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &amp;mu;g/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ovine wool cholesterol</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oleic acid/Gondoic acid</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol&lt;br/&gt; Concentration used: 1:1,000&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS&lt;br/&gt; Concentration used: 1:100&lt;br/&gt; Storage: -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 50 &amp;mu;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 200 &amp;mu;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++&lt;br/&gt; Comments: Use when ice-cold</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &amp;mu;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &amp;mu;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &amp;mu;g/mL insulin, 100 &amp;mu;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite&lt;br/&gt; Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td></tr><tr><td>Collagen IV Coating</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing 2 &amp;mu;g/mL collagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &amp;mu;L 1 M CaCl2, 5 &amp;mu;L 1 M MgCl2&lt;br/&gt; Comments: Mix well after the addition of&amp;nbsp; CaCl2 and MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &amp;mu;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &amp;mu;g/mL heparan sulfate, 0.1 &amp;mu;g/ml oleic acid, and 0.001 &amp;mu;g/ml gondoic acid&lt;br/&gt; Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &amp;deg;C and do not add more than 1.5 &amp;mu;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

מיקרוגלייה לייצג 5-10% של כל התאים במערכת העצבים המרכזית (CNS), יותר ויותר מושכים תשומת לב בשל תרומתם במהלך הפיתוח, הומאוסטזיס, ומחלות. למרות מקרופאגים נחקרו בפירוט במשך עשרות שנים, תכונות מיוחדות של מיקרוגלייה, את המקרופאגים רקמות תושב של מערכת העצבים, נותרו במידה רבה מסתורי, בין השאר בשל מגבלות ביכולת להתרכז microglial בוגרת מאפיינים בתרבות. כאן, אנחנו להמחיש תהליך פשוט לבידוד מהירה של מיקרוגלייה טהור מהמוח מכרסמים בוגרת. אנו מתארים גם תנאים תרבות ללא סרום התומכים רמות גבוהות של הכדאיות microglial לאורך זמן. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה מוגדרים-בינוני התערוכה תהליכים כחוד משוכלל והתנהגות מעקב דינמי. אנו להמחיש כמה תופעות של סרום חשיפה על מיקרוגלייה בתרבית, לדון איך תרבויות אלה ללא סרום בהשוואה הן תרבויות החשופים סרום, כמו גם מיקרוגלייה בתוך vivo.

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי מיקרוגלייה טוהר גבוהה כחוד תרבות של חולדות לנוער. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות בעלי חיים ילדותית, הלידה, למבוגרים, כפי שמתואר להלן. מאז תא ומשום כוללים לעיתים קרובות בניואנסים, הזדמנויות רבות עבור תאים למות, השתמשנו בקרת איכות מחסומים כדי לקב?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium at JoVE.com

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Views.  Stanford University. יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

Video: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Immunology and Infection

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

Source: Wolfes, A. C., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56092">Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

טכניקה פשוטה לבידוד ותרבית אסטרוציטים מורינים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Rat or Mouse Brain Dissection
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

Source: Jebelli, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52983">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

הסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית נוירונים של גרגיר המוח הקטן של חולדה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Instruments, ...

Co-culture and Interaction Studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...