Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas en los institutos nacionales de salud [Grant número R01 AI117211 AI130060 R01, AI127954 R21 y R42 AI106375 a BS] y nos Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].

Todos los procedimientos que involucran animales deben ser aprobados por el investigador institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).
1. preparación del inóculo bacteriano
<ol><li>Aislar colonias bacterianas.<ol>
<li>Racha de una cepa bacteriana (p. ej., a. baumannii "HUMC1") en medio de agar estéril adecuada (por ejemplo, agar soja tríptico), teniendo cuidado de generar colonias aisladas.</li>
		<li>Incubar en condiciones apropiadas (por ejemplo, durante la noche a 37 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crecer el cultivo durante la noche.<ol>
<li>Seleccione a un representante de Colonia aislada de la placa de agar con un asa de inoculación estéril y se usa para inocular 10 mL de medio de caldo estéril adecuada (por ejemplo, caldo de soja tríptica).</li>
		<li>Permita que la muestra llegar a la fase estacionaria en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crecer la subcultura.<ol>
<li>Transferir 100 μL de la cultura durante la noche a 10 mL de caldo estéril fresca con ayuda de una pipeta.</li>
		<li>Permiten llegar a la fase exponencial/registro en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3 horas en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave la subcultura.<ol>
<li>Retire la subcultura de su entorno de incubación.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias.</li>
		<li>Aspirar y descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) al pellet y vortex vigorosamente, hasta que completamente suspendidas.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.2 - 1.4.4 dos veces, para un total de 3 lavados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajustar la concentración de la suspensión bacteriana.<ol>
<li>Usando un espectrofotómetro que mide la densidad óptica a 600 nm (OD600), medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana.</li>
		<li>Añadir PBS estéril en la suspensión bacteriana hasta que la densidad óptica del inóculo a un OD600 de 0.5, utilizando la ecuación C× V = Cf× Vf, donde "C" es la concentración, "V" es el volumen, "" es inicial, y "f" es final. * Cf debe ser siempre 0,5; Vf es la variable a resolver.</li>
		<li>Si la suspensión bacteriana cae por debajo de un OD600 0.5, centrifugar a 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante a un OD600 de 0.5.</li>
		<li>Realizar diluciones seriadas en PBS estéril (p. ej., tres diluciones 1: 100 para lograr 1 × 10-6) y la placa de agar estéril para determinar el coeficiente de correlación que revela la concentración bacteriana en la formación de Colonia unidades por mL (UFC/mL) a un OD600 de 0.5. Nota: El valor de este coeficiente de correlación puede variar para cada cepa de cada especie y debe ser determinado antes de la preparación del inóculo para una infección.</li>
		<li>Después de determinar el coeficiente de correlación, utilizarlo para crear un inóculo de la concentración deseada (p. ej., 2 × 108- 1 × 109 UFC/mL); Si el inóculo deseado es mayor que el OD600 0.5, centrifugar la suspensión bacteriana en 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante para alcanzar la concentración deseada.</li>
		<li>Realizar en vivo estudios piloto para determinar la virulencia de cada cepa bacteriana en cada cepa de ratón, estos valores pueden variar entre aislamientos bacterianos de la misma especie y ratones de diferentes fondos genéticos. Para varias especies Gram-negativas, LD100 en ratones es generalmente 1-5 × 108 UFC/ratón, aunque algunas cepas son letales en inóculos inferiores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congelar alícuotas idénticas para uso futuro como inóculo en la demanda, precisa, como previamente publicados8 (opcional).<ol>
<li>Preparar 1 L de inóculo bacteriano como se describe anteriormente, transferencia a dos frascos cónicos de 500 mL y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Deseche 450 mL del sobrenadante de cada frasco cónico y resuspender el pellet de bacterias en el sobrenadante restante.</li>
		<li>Transferir el inóculo bacteriano concentrado a un vaso de precipitados de 250 mL que contiene una barra de agitación magnética y mezclar continuamente en la parte superior una placa de agitación 300 RPM.</li>
		<li>Cuidadosamente transfiera exactamente 600 μL del inóculo bacteriano concentrado (p. ej., 1 × 1010 UFC/mL) usando una pipeta a un frasco de 1,6 mL criogénico que contiene exactamente 300 μL de estéril de H2O y 300 μL de glicerol estéril; mezclar y almacenar a-80 ° C. Nota: El glicerol necesario para almacenamiento puede confundir los resultados experimentales y causar exceso de mortalidad, por lo que es necesario lavar a cabo.</li>
		<li>Cuando esté listo para su uso, descongelar la muestra 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Transferir 1 mL a un frasco cónico de 50 mL, añadir 9 mL de PBS estéril y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias. Aspirar el sobrenadante y resuspender la cantidad predeterminada de UFC (× 1 mL congelada stock concentración en UFC/mL) en un volumen adecuado de PBS para alcanzar la concentración deseada para el inóculo infeccioso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anestesiar ratones
<ol><li>Ketamina/xilacina Nota: La anestesia con ketamina/xilacina tiene una larga duración, que ofrece el tiempo suficiente para el investigador que es nuevo en esta técnica para completar el procedimiento de inoculación antes de que el ratón se despierta.<ol>
<li>Preparar 10 mL de solución inyectable combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal grado PBS, 1 mL de 100 mg/mL ketamina solución (concentración final 10 mg/mL) y 0.5 mL de xilacina solución stock de 20 mg/mL (concentración final 10 mg/mL).</li>
		<li>Administrar 10 μL/g por inyección intraperitoneal de (IP) (por ejemplo, 250 μL de un ratón de 25 g).</li>
		<li>Aplicar ungüento oftálmico en los ojos de los ratones anestesiados con ketamina/xilacina porque sus ojos son propensos a daños durante largos periodos de la anestesia.</li>
		<li>Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia. Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoflurano Nota: Ratones rápidamente despiertan de la anestesia isoflurano-inducida después de ser eliminado de la cámara de inducción, por lo que este método de anestesia sólo debe utilizarse después de ser competente en el procedimiento de inoculación.<ol>
<li>Colocar los ratones ingenuos en una cámara de tamaño adecuado de la inducción con flujo de oxígeno.</li>
		<li>Después de que la cámara está sellada, anestesiar los ratones utilizando un vaporizador de precisión para añadir isoflurano en el 4% (v/v) por menos de 5 min; la anestesia para confirmar eliminación de un ratón de la cámara de inducción y medir cuánto tarda en despertarse de la anestesia (~ 60 s). Nota: Tenga en cuenta que anestesia los tiempos pueden variar basado en las directrices y algunos animales pueden requerir más de 5 minutos para ser completamente anestesiada.</li>
		<li>Mantener la anestesia hasta 10 minutos ajustando la concentración de isoflurano al 2-3%; Si la duración total de la anestesia es > 15 minutos, aplicar pomada oftálmica en los ojos de los ratones anestesiados.</li>
		<li>Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inocular/infectar ratones
<ol><li>Suspender un ratón anestesiado, colgando de sus incisivos superiores sobre una cuerda fuerte y delgada (por ejemplo, seda dental) fijado a un objeto fijo a una altura aproximadamente dos veces del ratón longitud de cuerpo (p. ej., 20 cm) por encima de la superficie de funcionamiento (p. ej. Banco de laboratorio).</li>
	<li>Tire suavemente de la lengüeta del ratón de su boca con unas pinzas estériles, punta Roma. Transferencia de la lengua a un dedo enguantado estéril para evitar aplastamiento accidental de la lengua del ratón. Mantener la lengua fuera de la boca, permitiendo el acceso a la orofaringe y prevención de la ingestión del inóculo al lado.</li>
	<li>Mientras sujeta la lengua del ratón, colocar el inóculo de 50-μL (suspensión bacteriana) en la orofaringe utilizando una micropipeta; la orofaringe está situada en el cruce de la cavidad bucal y la faringe hacia la parte posterior de la boca. Nota: Es muy importante entregar sólo líquido transfiriendo a la primera parada de la micropipeta. El ratón dejará de respirar durante unos segundos cuando el inóculo se coloca en la orofaringe; Finalmente, aspiración reflexiva hará que el ratón inhalar la suspensión bacteriana, indicada por la crepitación característico de líquido en los pulmones, que resulta en la infección por neumonía.</li>
	<li>Si el inóculo no se coloca muy atrás lo suficiente como para bloquear la respiración normal, pellizcar las narinas con pinzas a la fuerza de aspiración reflexiva a través de la boca y posterior inhalación del inóculo.</li>
	<li>Después de la inoculación, soltar la lengua, quitar el mouse de la cadena de suspensión, colocarlo en una jaula y monitorear hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.</li>
</ol>4. monitoreo de la progresión de la enfermedad
Nota: Debido al sufrimiento de los animales, varios indicadores deben utilizarse para indicar cuando ratones moribundos; eutanasia se debe realizar esta determinación, de conformidad con un protocolo previamente aprobado de IACUC; diversos marcadores de la trata incluyen la temperatura corporal, pérdida de peso, aspecto, marcha y otros biomarcadores que pueden obtenerse de la sangre (por ejemplo, a través de iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
<ol><li>Eutanasia a los ratones según protocolo previamente aprobado de IACUC (p. ej., de CO2 seguido por dislocación cervical).</li>
	<li>Retire los pulmones de ratón sacrificaron mediante la reducción de la tráquea, la arteria pulmonar y vena pulmonar cerca de los pulmones.<ol>
<li>Microscopia<ol>
<li>Colocar los pulmones (o porción) en un molde de la muestra.</li>
			<li>Llenar el molde de la muestra con temperatura óptima de corte (O.C.T.) compuesto, sumergir completamente el tejido.</li>
			<li>Congelación de la muestra a-80 ° C.</li>
			<li>Enviar la muestra a un laboratorio de patología para la sección y montar en portaobjetos para microscopía.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carga bacteriana<ol>
<li>Pesa el tejido pulmonar con una balanza analítica.</li>
			<li>Transferir el tejido pulmonar al frasco cónico de 50 mL que contiene 2-5 mL de PBS estéril (dependiendo del tamaño del tejido).</li>
			<li>Homogeneizar el tejido pulmonar con un homogeneizador de tejidos.</li>
			<li>Realizar diluciones seriadas del homogeneizado de la PBS estéril para lograr aproximadamente 1.000 ufc/mL, basado en la carga bacteriana esperada en los pulmones.<ol>
<li>Por ejemplo, si se espera que 1 × 109 UFC/mg, realizar tres diluciones 1: 100: transferir 100 μL de homogenado a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; se trata de la primera dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la primera dilución 1: 100 en 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la segunda dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la dilución 1: 100 segundo a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la dilución 1: 100 tercer y final.</li>
				<li>Si se desconoce la carga bacteriana en los pulmones, realizar una serie de diluciones para capturar el rango esperado.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Añadir placa sobre agar estéril.<ol>
<li>Preparar caldo de soja tríptica el estéril (TSB) con las placas de agar (TSA): cosechadora 30 g de TSB, 15 g de agar, 1 L de agua, mezclar con un agitador magnético y calentar hasta que hierva a ~ 100 ° C durante 5 minutos dejar enfriar y luego autoclave en el ciclo líquido durante 15 minutos dejar enfriar ~ 55 ° C, la transferencia recién esterilizada 10 mL TSA a cajas Petri estériles y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Deje seca de sobremesa para 2-5 d o descubierto debajo de un gabinete de 10 min de bioseguridad.</li>
				<li>Transferir 100 μL de la dilución a una caja de Petri que contenga estéril TSA y repartidos en TSA con perlas de vidrio o esparcidor.</li>
				<li>Guarde la caja Petri durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada (es decir, que contiene un vaso de 1 L al descubierto llenada de agua de la incubadora de 37 ° C)</li>
			</ol>
</li>
			<li>Determinar homogeneizado de pulmón UFC/mL en placas de agar base (por ejemplo, 100 unidades formadoras de colonias en placa de TSA con 100 μL de dilución del tercer y último descrito sería 100 UFC/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).</li>
			<li>Calcular el tejido pulmonar de UFC/mg base dividiendo homogeneizado de pulmón UFC/mL de homogeneizado de tejido/mL de pulmón mg (por ejemplo, si muestra descrita anteriormente utilizado 100 mg de tejido pulmonar homogeneizado en 5 mL de PBS, luego 1 × 109 UFC/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spellberg, B., Talbot, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+Design+Features+of+Future+Clinical+Trials+of+Antibacterial+Agents+for+Hospital-Acquired+Bacterial+Pneumonia+and+Ventilator-Associated+Bacterial+Pneumonia.">Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia.</a> Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).</li><li>Kalil, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Adults+With+Hospital-acquired+and+Ventilator-associated+Pneumonia:+2016+Clinical+Practice+Guidelines+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America+and+the+American+Thoracic+Society.">Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society.</a> Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).</li><li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia.">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).</li><li>Azoulay-Dupuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+a+new+fluoroquinolone,+sparfloxacin,+against+penicillin-susceptible+and+-resistant+and+multiresistant+strains+of+Streptococcus+pneumoniae+in+a+mouse+model+of+pneumonia.">In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).</li><li>Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+pneumonia.">Animal models of human pneumonia.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (3), L387-L398 (2008).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li><li>Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loss+and+reduced+body+temperature+determine+humane+endpoints+in+a+mouse+model+of+ocular+herpesvirus+infection.">Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).</li><li>Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+endpoint+for+an+intranasal+invasive+pulmonary+aspergillosis+mouse+model.">Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model.</a> Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).</li><li>Nielsen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Exacerbates+Infection+via+Hyperinflammation+by+Signaling+through+TLR4+and+RAGE.">Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li><li>Nielsen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibody+Protects+Against+Acinetobacter+baumannii+Infection+by+Enhancing+Bacterial+Clearance+and+Evading+Sepsis.">Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis.</a> Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).</li><li>Cheng, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+serotypes+5+and+8+capsular+polysaccharides+in+protection+against+Staphylococcus+aureus+in+murine+models+of+infection.">Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection.</a> Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).</li><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+Pathophysiological+Overview+of+Acinetobacter+Infections:+a+Century+of+Challenges.">Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Sin duda, los ratones no son seres humanos miniatura. Resultados obtenidos en modelos de ratón deben ser considerados en contexto y posteriormente interpretadas para su aplicación a seres humanos, basada en las diferencias y similitudes entre las dos especies6. También es importante elegir la cepa de ratón apropiado como algunos son más susceptibles a algunas infecciones que otros; lo mismo se aplica a la cepa del patógeno de elección16.
E...

Infección de vías respiratoria inferiores es la enfermedad contagiosa más mortífera del mundo y la causa más común de muerte en los países en desarrollo1. Estas infecciones representan a nivel mundial, más de 3,2 millones de muertes de1. Además, neumonía nosocomial es una de las formas más comunes y mortales de salud infecciones adquiridas y es causada por los patógenos más resistentes a los antibióticos2,3. La ruta típica de adquisición de neumonía bacteriana tanto adquiridas en la comunidad y neumonía nosocomial es la aspiración de contenido orofaríngeo en el alvéolo. Modelos murinos utilizados para estudiar estas enfermedades a menudo utilizan la inoculación intranasal4, depositando gran parte de las bacterias fuera de los pulmones, causando síntomas como sinusitis o trauma físico, que son incongruentes con la enfermedad y las complicaciones fuera del objetivo progresión en humanos que los modelos fueron diseñados para emular. Otros modelos pueden utilizar cámaras de inhalación y los dispositivos micromisting, que más exactamente imitan a neumonías virales, tuberculosas y micóticas, pero exactamente no recapitular la ruta normal de adquisición de las neumonías bacterianas típicas.
El modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea puede utilizarse para simular la ruta natural y patogenia de la neumonía bacteriana. Por inoculación 50 μl de la suspensión bacteriana en la orofaringe de ratones anestesiados con una pipeta, sobreviene la aspiración reflexiva, que produce neumonía infecciosa. Usando este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades con un modelo de fidelidad mayor, más análogo a las infecciones de neumonía de aspiración observadas en humanos. Además, a diferencia de modelos similares que infectan a través de la cavidad bucal5,6, este modelo asegura que el inóculo completo llegue a los pulmones en lugar del intestino, donde puede causar inflamación externa e infecciones, como gastritis y la enteritis. Por último, a diferencia del otro modelo publicado que requiere un laringoscopio y que inocula a través de la tráquea7, este modelo no obstruye la vía aérea con una aguja de la sonda y no requiere de inyección para la entrega de inóculo. Por el contrario, la inoculación se basa en el reflejo de la aspiración natural del ratón.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214530</td>
			<td>Combine with TSB to make TSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, Borosilicate Glass</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>135003</td>
			<td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 250 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1003</td>
			<td>Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td>Capable of 4,000&#215;g at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber for Anesthesia</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>VetFlo-0720</td>
			<td>Accommodates up to 5 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Intermediate Size</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Disposable vinyl specimen molds, 15&#215;15&#215;5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Floss</td>
			<td>Oral-B</td>
			<td>37000469537</td>
			<td>Tie to stable post approx. 6&#34; above table height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td>Used to gently pull tongue out of mouse&#39;s mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer for Lung Tissue</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>TM125-115</td>
			<td>Autoclave before first use; rinse between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane for Anesthesia</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>10015516</td>
			<td>Alternative drug can be used; modify procedure accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSTAT Cartridge</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>03P79-25</td>
			<td>Various cartridges are available to suit your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine, 100 mg/mL</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>4165</td>
			<td>Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for Eyes</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>Tears Renewed</td>
			<td>Avoid touching eye with tip of dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>Used to freeze lung samples at -80 &#176;C to prepare for pathology sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Polystyrene, disposable, sterilized, 100&#215;15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200-&#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter, 200-&#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Autoclave and calibrate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreader, Bacterial Cell</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F377360006</td>
			<td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter &#215; 38.1 mm Length</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-150</td>
			<td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate, Magnetic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-620D</td>
			<td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td>Combine with Agar to make TSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Conical, Sterile, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431720</td>
			<td>Used for preparing bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Conical, Sterile, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td>Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Cryogenic, 2.0 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 20 mg/mL</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia

Modelos murinos de infección son fundamentales para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica novedosa para combatir agentes patógenos causales. Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes que presentan los pacientes en la clínica y así garantiza un modelo apropiado en vivo . Neumonía típica modelos utilizan la inoculación intranasal, que deposita excesiva organismos fuera del pulmón, causando complicaciones fuera del objetivo y los síntomas, tales como sinusitis, gastritis, enteritis, trauma físico o micropartículas de la bruma para imitar el aerosol propagación más típica de la neumonía viral, tuberculosa o micótica. Estos modelos no reflejan con exactitud la patogenia de la neumonía bacteriana típica o healthcare-adquirida en la comunidad. En contraste, este modelo murino de neumonía por aspiración orofaríngea imita el recorrido de la gota en neumonía adquirida en el cuidado de la salud. Suspensión en la orofaringe de ratones anestesiados inocular 50 μl de las bacterias hace que aspiración reflexiva, que produce neumonía. Con este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades.

Con cuidado, siguiendo el protocolo, pueden obtenerse fácilmente reproducibles y robustos de datos. Es importante apegarse estrictamente a la personalizada inóculo preparación protocolo para experimentos para ser comparado con una entre sí. También es importante manejar adecuadamente los ratones durante el proceso de infección. Asegúrese de colocar ratones en una cámara de anestesia desprovisto de isoflurano. Ratones se asuste si se colocan en una cámara que ha sido previamente l...

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Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.

Modelo murino de aspiración orofaríngea de neumonía bacteriana asociada a la ventilación y adquirida en el Hospital

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K vistas.  University of Southern California. Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.

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Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murino hepática Bioluminiscente modelo tumoral

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

Manipulación Osteopática como herramienta complementaria útil para la Neumonía

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Inflamación Modelo de candidiasis orofaríngea en ratones inmunodeficientes

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Un modelo murino de irreversible y reversible obstrucción ureteral unilateral

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration (E-TTNA) for Sampling of Lung Nodules

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently available to sample nodules for pathological diagnosis. Those technologies can be divided into bronchoscopic and non-bronchoscopic interventions. Electromagnetic navigational bronchoscopy is being extensively used for the endobronchial approach to peripheral lung nodules but has been hindered by anatomic challenges resulting in a 70% diagnostic yield. Electromagnetic navigational guided transthoracic needle lung biopsy is novel non-bronchoscopic method that uses a percutaneous electromagnetic tip tracked needle to obtain core biopsy specimens. Electromagnetic navigational transthoracic needle aspiration complements bronchoscopic techniques potentially allowing the provider to maximize the diagnostic yield during one single procedure. This article describes a novel integrated diagnostic approach to pulmonary lung nodules. We propose the use of endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration (EBUS-TBNA) for mediastinal staging; radial EBUS, navigational bronchoscopy and E-TTNA during one single procedure to maximize diagnostic yield and minimize the number of invasive procedures needed to obtain a diagnosis. This manuscript describes in detail how the navigation transthoracic procedure is performed. Additional clinical studies are needed to determine the clinical utility of this novel technology.

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration E-TTNA for Sampling of Lung Nodules

We describe the novel use of electromagnetic navigational guided transthoracic needle aspiration for the pathologic assessment of human lung nodules.

El uso de la navegación electromagnética transtorácica aspiración con aguja (E-ITAN) de muestreo de nódulos pulmonares

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.