Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e malattie infettive presso il National Institutes of Health [Grant numeri R01 AI117211, R01 AI130060, la R21 AI127954 e R42 AI106375 BS] e US Food and Drug Administration [contratto HHSF223201710199C a BML].

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali devono essere approvate dal ricercatore istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).
1. preparazione dell'inoculo batterico
<ol><li>Isolare le colonie batteriche.<ol>
<li>Striscia un ceppo batterico (ad es., a. baumannii "HUMC1") su appropriato sterile agar (ad es., agar soia triptico), facendo attenzione a generare colonie isolate.</li>
		<li>Incubare a condizioni appropriate (ad esempio, durante la notte a 37 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Far crescere cultura durante la notte.<ol>
<li>Selezionare un rappresentante, Colonia isolata dalla piastra di agar con un'ansa sterile da inoculo e utilizzarlo per inoculare 10 mL di terreno di brodo sterile appropriato (ad es., brodo di soia triptico).</li>
		<li>Lasciare il campione raggiungere la fase stazionaria in condizioni adeguate (ad es., 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte in un flaconcino di forma conico tappo sfiato, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescere la sottocultura.<ol>
<li>Trasferire 10 mL di brodo sterile fresco utilizzando una pipetta 100 μL di coltura durante la notte.</li>
		<li>Permettono di raggiungere la fase esponenziale/registro alle condizioni adeguate (ad es., 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per 3 h in un flaconcino di forma conico tappo sfiato, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare la sottocultura.<ol>
<li>Rimuovere la sottocultura dal suo ambiente di incubazione.</li>
		<li>Centrifugare a 4.000 × g per 5 min appallottolare i batteri.</li>
		<li>Aspirare e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS) per il pellet e vortexare energicamente fino a quando completamente in sospensione.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.4.2 - 1.4.4 due volte, per un totale di 3 lavaggi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare la concentrazione di sospensione batterica.<ol>
<li>Utilizzando uno spettrofotometro che misura la densità ottica a 600 nm (OD600), misurare la densità ottica della sospensione batterica.</li>
		<li>Aggiungere PBS sterile alla sospensione batterica fino a quando la densità ottica dell'inoculo scende a un OD600 pari a 0,5, utilizzando l'equazione Cho× Vho = Cf× Vf, dove "C" è la concentrazione, "V" è il volume, "io" è iniziale, e "f" è definitiva. * Cf dovrebbe sempre essere 0,5; Vf è la variabile da risolvere.</li>
		<li>Se la sospensione batterica scende sotto un OD600 di 0,5, e centrifugare a 4.000 × g per 5 min a pellet i batteri e rimuovere una quantità appropriata di surnatante per raggiungere un OD600 pari a 0,5.</li>
		<li>Effettuare diluizioni seriali nel PBS sterile (ad esempio, tre diluizioni 1: 100 per raggiungere 1 × 10-6) e la piastra su agar sterili per determinare il coefficiente di correlazione che rivela la concentrazione batterica in formanti colonie unità / mL (CFU/mL) a un OD600 pari a 0,5. Nota: Il valore di questo coefficiente di correlazione varia per ogni ceppo di ogni specie e deve essere determinato prima della preparazione dell'inoculo per un'infezione.</li>
		<li>Dopo aver determinato il coefficiente di correlazione, utilizzarlo per creare un inoculo di ottenere la concentrazione desiderata (ad es., 2 × 108- 1 × 109 CFU/mL); Se l'inoculo desiderata è maggiore rispetto al OD600 pari a 0,5, centrifugare la sospensione batterica a 4.000 × g per 5 min a pellet i batteri e rimuovere una quantità appropriata di surnatante per raggiungere la concentrazione desiderata.</li>
		<li>Eseguire in vivo studi pilota per determinare la virulenza di ogni isolato batterico in ogni sforzo del topo come questi valori variano tra gli isolati batterici della stessa specie e topi di diverso background genetico. Per diverse specie gram-negativi, LD100 nei topi è generalmente 1-5 × 108 CFUs/mouse, anche se alcuni ceppi sono letali a inoculi inferiori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congelare aliquote identiche per uso futuro come inoculi on demand, precisi, come precedentemente pubblicati8 (opzionale).<ol>
<li>Preparare 1 L di inoculo batterico come descritto sopra, trasferimento a due fiale coniche 500 mL e centrifugare a 4.000 × g per 5 min.</li>
		<li>450 mL di surnatante da ogni flaconcino conico di scartare e risospendere il pellet di batteri nel surnatante rimanente.</li>
		<li>Trasferire l'inoculo batterico concentrato in un becher da 250 mL contenente un'ancoretta magnetica e mescolare continuamente sopra una piastra stir a 300 giri/min.</li>
		<li>Trasferire con cautela esattamente 600 μL di concentrato inoculo batterico (ad es., 1 × 1010 CFU/mL) usando una pipetta un flaconcino criogenico di 1,6 mL contenente esattamente 300 μL di sterile H2O e 300 μL di glicerolo sterile; mescolare e conservare a-80 ° C. Nota: Il necessario per la memorizzazione di glicerolo può confondere i risultati sperimentali e causare mortalità in eccesso, quindi è necessario lavare fuori.</li>
		<li>Quando si è pronti per l'uso, scongelare il campione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Trasferire 1 mL in un flacone conico da 50 mL, aggiungere 9 mL di PBS sterile e centrifugare a 4.000 × g per 5 min appallottolare i batteri. Aspirare il supernatante e risospendere il quantitativo predeterminato di CFUs (mL 1 × congelati stock concentrazione in CFU/mL) in un volume adeguato di PBS per raggiungere la concentrazione desiderata per l'inoculo infettiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anestetizzante topi
<ol><li>Chetamina/xilazina Nota: L'anestesia con chetamina/xilazina ha una lunga durata, che offre il tempo sufficiente per il ricercatore che è di nuovo a questa tecnica per completare la procedura di inoculo prima che il mouse si risveglia.<ol>
<li>Preparare 10 mL di soluzione iniettabile combinando 8,5 mL di pharmaceutifcal grado PBS, 1 mL di 100 mg/mL soluzione di riserva di ketamina (concentrazione finale 10mg/mL) e 0,5 mL di 20 mg/mL soluzione stock xilazina (concentrazione finale di 10 mg/mL).</li>
		<li>Somministrare 10 μL/g tramite l'iniezione intraperitoneale (IP) (ad es., 250 μL per un mouse 25-g).</li>
		<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi anestetizzati con chetamina/xilazina perché i loro occhi sono soggette a danni durante periodi prolungati di anestesia.</li>
		<li>Posizionare il mouse in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia. Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoflurano Nota: Topi rapidamente sveglia dall'anestesia indotta da isoflurane dopo essere stato rimosso dalla camera di induzione, quindi questo metodo di anestesia dovrebbe essere utilizzato solo dopo essere diventato abile alla procedura di inoculo.<ol>
<li>Posizionare i topi ingenuo in una camera di dimensioni adeguate ad induzione con ossigeno che scorre.</li>
		<li>Dopo che la camera è sigillata, anestetizzare i topi utilizzando un vaporizzatore di precisione per aggiungere isoflurano al 4% (v/v) per almeno 5 min; confermare l'anestesia rimuovendo un mouse dalla camera di induzione e misura quanto tempo ci vuole per svegliarsi dall'anestesia (~ 60 s). Nota: Tenere presente che l'anestesia, i tempi possono variare basato sulle linee guida istituzionali e alcuni animali potrebbero necessitare di più di 5 min per diventare completamente anestetizzato.</li>
		<li>Mantenere l'anestesia per fino a 10 min regolando la concentrazione di isoflurane per 2-3%; Se la durata totale dell'anestesia è > 15 min, applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi anestetizzati.</li>
		<li>Posizionare il mouse in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia, come descritto al punto 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inoculare/infettando topi
<ol><li>Sospendere un mouse anestetizzato, appeso da suoi incisivi superiori su una stringa forte, sottile (ad es., filo interdentale) fissati ad un oggetto fisso ad un'altezza circa due volte del mouse lunghezza del corpo (ad es., 20 cm) sopra la superficie operativa (ad es. banco di laboratorio).</li>
	<li>Tirare delicatamente la linguetta del mouse fuori dalla sua bocca utilizzando pinze sterili, smussato-conclusa. Trasferire la lingua un dito guantato, sterile antischiacciamento accidentale della linguetta del mouse. Tenere la lingua fuori della bocca, consentendo l'accesso all'orofaringe e impedendo la deglutizione dell'inoculo al lato.</li>
	<li>Tenendo la linguetta del mouse, inserire l'inoculo di 50 μL (sospensione batterica) l'orofaringe utilizzando una micropipetta; l'orofaringe è situato all'incrocio tra la cavità orale e della faringe verso il retro della bocca. Nota: È molto importante trasmettere solo liquido di pipettaggio per la prima tappa della micropipetta. Il mouse sarà smettere di respirare per alcuni secondi quando l'inoculo è collocato nell'orofaringe; alla fine, riflessivo aspirazione causerà il mouse per inalare la sospensione batterica, indicata dal rumore caratteristico crepitio di liquido di penetrare nei polmoni, che si traduce nell'infezione di polmonite.</li>
	<li>Se l'inoculo è posizionato non lontano indietro abbastanza per bloccare la respirazione normale, pizzicare le narici con il forcipe per forzare riflessivo aspirazione attraverso la bocca e la successiva inalazione dell'inoculo.</li>
	<li>Dopo l'inoculazione, sganciare la linguetta, rimuovere il mouse dalla stringa di sospensione, metterlo in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia, come descritto al punto 2.1.</li>
</ol>4. monitorare la progressione della malattia
Nota: A causa di sofferenza animale, vari indicatori dovrebbero essere utilizzati per indicare quando i topi diventano moribondi; l'eutanasia deve essere eseguita seguendo questa determinazione, secondo un protocollo IACUC precedentemente approvato; i vari indicatori di moribundity includono la temperatura corporea, perdita di peso, aspetto, andatura e altri biomarcatori che possono essere ottenuti dal sangue (ad es., tramite iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
<ol><li>Eutanasia i topi secondo protocollo IACUC precedentemente approvato (ad es., CO2 seguita da dislocazione cervicale).</li>
	<li>Rimuovere i polmoni da mouse eutanasizzato tagliando trachea, arteria polmonare e della vena polmonare vicino ai polmoni.<ol>
<li>Microscopia<ol>
<li>Posizionare i polmoni (o parte) in uno stampo di esemplare.</li>
			<li>Riempite lo stampo di esemplare con ottimale taglio temperatura (t.o.c.) composto, sommergendo completamente il tessuto.</li>
			<li>Congelare il campione a-80 ° C.</li>
			<li>Inviare il campione ad un laboratorio di patologia di sezione e montare su vetrini per microscopia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carica batterica<ol>
<li>Pesare il tessuto polmonare una bilancia analitica.</li>
			<li>Trasferire il tessuto polmonare al flaconcino conico da 50 mL contenente 2-5 mL di PBS sterile (a seconda delle dimensioni del tessuto).</li>
			<li>Omogeneizzare il tessuto polmonare con un omogeneizzatore del tessuto.</li>
			<li>Effettuare diluizioni seriali dell'omogenato in PBS sterile fino a raggiungere circa 1.000 CFU/mL, basato su previsto carica batterica nei polmoni.<ol>
<li>Ad esempio, se è previsto 1 × 109 CFU/mg, eseguire tre diluizioni 1: 100: trasferire 100 μL di omogenato a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la prima diluizione di 1: 100. Trasferire 100 µ l della diluizione 1: 100 prima a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la seconda diluizione 1: 100. Trasferire 100 µ l della diluizione 1: 100 seconda a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la diluizione di 1: 100 terzo e finale.</li>
				<li>Se la carica batterica nei polmoni è sconosciuto, eseguire una serie di diluizioni di catturare nell'intervallo previsto.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Diluizioni di piastra su agar sterile.<ol>
<li>Preparare sterile Tryptic Soy brodo (TSB) con piastre di agar (TSA): 30 g di TSB Combine, 15 g di agar e 1 L di acqua, mescolare con un agitatore magnetico e riscaldare fino ad ebollizione a ~ 100 ° C per 5 min, Consenti per raffreddare e quindi autoclave su ciclo liquido per 15 min. Consenti raffreddare a ~ 55 ° C, trasferimento 10 mL appena sterilizzato nell'autoclave TSA di Petri sterili e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Lasciate asciugare su benchtop per 2-5 d o scoperto sotto una cappa di biosicurezza per 10 min.</li>
				<li>Trasferire 100 µ l della diluizione a una piastra Petri contenente TSA sterile e si sono diffuse attraverso TSA utilizzando una spatola o perline di vetro.</li>
				<li>Memorizzare la capsula di Petri durante la notte a 37 ° C in un incubatore (cioè, incubatore 37 ° C contenente un becher 1L scoperto riempito d'acqua)</li>
			</ol>
</li>
			<li>Determinare omogeneato del polmone CFU/mL sulla placcatura agar basata (ad esempio, 100 CFUs sulla piastra TSA con 100 μL di terza e ultima diluizione sopra descritto sarebbe 100 CFU/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil n. 3 = 1 × 109 CFUs/mL).</li>
			<li>Calcolare il tessuto polmonare CFUs/mg basato dividendo omogeneato del polmone CFU/mL di mg del polmone omogenato di tessuto/mL (per esempio, se utilizza un campione descritto sopra 100 mg di tessuto polmonare omogeneizzato in 5 mL di PBS, poi 1 × 109 CFU/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spellberg, B., Talbot, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+Design+Features+of+Future+Clinical+Trials+of+Antibacterial+Agents+for+Hospital-Acquired+Bacterial+Pneumonia+and+Ventilator-Associated+Bacterial+Pneumonia.">Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia.</a> Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).</li><li>Kalil, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Adults+With+Hospital-acquired+and+Ventilator-associated+Pneumonia:+2016+Clinical+Practice+Guidelines+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America+and+the+American+Thoracic+Society.">Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society.</a> Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).</li><li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia.">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).</li><li>Azoulay-Dupuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+a+new+fluoroquinolone,+sparfloxacin,+against+penicillin-susceptible+and+-resistant+and+multiresistant+strains+of+Streptococcus+pneumoniae+in+a+mouse+model+of+pneumonia.">In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).</li><li>Mizgerd, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+loss+and+reduced+body+temperature+determine+humane+endpoints+in+a+mouse+model+of+ocular+herpesvirus+infection.">Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).</li><li>Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+endpoint+for+an+intranasal+invasive+pulmonary+aspergillosis+mouse+model.">Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model.</a> Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).</li><li>Nielsen, T. 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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Per essere sicuri, topi non sono esseri umani in miniatura. Risultati ottenuti da modelli murini devono essere considerati nel contesto e successivamente interpretati per applicabilità agli esseri umani, basata su differenze e similitudini tra le due specie6. È anche importante scegliere il ceppo del mouse appropriato come certi sono più suscettibili di alcune infezioni rispetto ad altri; lo stesso vale per il ceppo patogeno di scelta16.
È es...

Infezione respiratoria più bassa è la malattia infettiva più mortale del mondo e la più comune causa di morte nei paesi in via di sviluppo1. Globalmente, queste infezioni rappresentano più di 3,2 milioni di morti nel1. Inoltre, polmonite nosocomiale è tra le forme più comuni e più mortale delle infezioni acquisite assistenza sanitaria ed è causata da agenti patogeni più resistenti agli antibiotici2,3. Il tipico percorso di acquisizione di polmonite batterica per entrambi acquisita in comunità e polmonite nosocomiale è l'aspirazione orofaringea contenuto negli alveoli. Modelli murini usati per studiare queste malattie spesso utilizzano inoculazione intranasale4, gran parte dei batteri di fuori del polmone, causando complicazioni fuori bersaglio e sintomi come sinusite e traumi fisici, che sono incongruenti con la malattia del deposito progressione in essere umano che i modelli sono stati progettati per emulare. Altri modelli possono utilizzare inalazione chambers e dispositivi di micromisting, che più accuratamente imitano le polmoniti virali, tubercolotiche e fungine, ma non con precisione ricapitolare il normale percorso di acquisizione per polmoniti batteriche tipiche.
Il modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino può essere utilizzato per simulare l'itinerario naturale e la patogenesi di polmonite batterica. Inoculando 50 µ l della sospensione batterica in orofaringe dei topi anestetizzati utilizzando una pipetta, riflessivo aspirazione segue, che si traduce in polmonite infettiva. Usando questo modello, si può esaminare la patogenesi degli agenti patogeni che causano polmonite e nuovi trattamenti per combattere queste malattie con un modello di fedeltà superiore, più simile alle infezioni di polmonite di aspirazione osservate nell'uomo. Inoltre, a differenza di modelli simili che infettare attraverso la cavità orale5,6, questo modello assicura che l'inoculo completo raggiunge i polmoni invece l'intestino, dove può causare infiammazione off-site e infezioni, come la gastrite ed enterite. Infine, a differenza di un altro modello pubblicato che richiede un laringoscopio e inoculates attraverso la trachea7, questo modello non ostruire le vie respiratorie con un ago sonda gastrica e non richiede l'iniezione per consegna di inoculo. Invece, l'inoculazione si basa sul riflesso di aspirazione naturale del mouse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214530</td>
			<td>Combine with TSB to make TSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, Borosilicate Glass</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>135003</td>
			<td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 250 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1003</td>
			<td>Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td>Capable of 4,000&#215;g at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber for Anesthesia</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>VetFlo-0720</td>
			<td>Accommodates up to 5 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Intermediate Size</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Disposable vinyl specimen molds, 15&#215;15&#215;5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Floss</td>
			<td>Oral-B</td>
			<td>37000469537</td>
			<td>Tie to stable post approx. 6&#34; above table height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-440</td>
			<td>Used to gently pull tongue out of mouse&#39;s mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer for Lung Tissue</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>TM125-115</td>
			<td>Autoclave before first use; rinse between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane for Anesthesia</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>10015516</td>
			<td>Alternative drug can be used; modify procedure accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSTAT Cartridge</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>03P79-25</td>
			<td>Various cartridges are available to suit your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine, 100 mg/mL</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>4165</td>
			<td>Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for Eyes</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>Tears Renewed</td>
			<td>Avoid touching eye with tip of dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>Used to freeze lung samples at -80 &#176;C to prepare for pathology sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Polystyrene, disposable, sterilized, 100&#215;15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200-&#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetter, 200-&#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Autoclave and calibrate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreader, Bacterial Cell</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F377360006</td>
			<td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter &#215; 38.1 mm Length</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58948-150</td>
			<td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate, Magnetic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-620D</td>
			<td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td>Combine with Agar to make TSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Conical, Sterile, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431720</td>
			<td>Used for preparing bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Conical, Sterile, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td>Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Cryogenic, 2.0 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 20 mg/mL</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia

Modelli murini di infezione sono fondamentali per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di approcci terapeutici progettati per combattere gli agenti patogeni causativi. Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni presentate dai pazienti nella clinica e garantisce così un modello appropriato in vivo . Polmonite tipica modelli utilizzano inoculazione intranasale, che depositi eccessivi organismi di fuori del polmone, causando complicazioni fuori bersaglio e sintomi, come la sinusite, gastrite, enterite, trauma fisico o microparticella di nebbia per imitare aerosol diffusione più tipica di polmonite virale, tubercolotica o da fungo. Questi modelli non riflettono accuratamente la patogenesi di polmonite batterica tipica di comunità o assistenza sanitaria acquistata. Al contrario, questo modello murino di polmonite di aspirazione orofaringea imita l'itinerario della gocciolina in polmonite acquisita in assistenza sanitaria. Inoculando 50 µ l di batteri sospensione nell'orofaringe dei topi anestetizzati causa aspirazione riflessivo, che si traduce in polmonite. Con questo modello, si può esaminare la patogenesi degli agenti patogeni che causano polmonite e nuovi trattamenti per combattere queste malattie.

Seguendo scrupolosamente il protocollo, riproducibili e affidabili dati possono essere facilmente ottenuti. È fondamentale rispettare rigorosamente di uno protocollo di preparazione dell'inoculo su misura per esperimenti per essere paragonato a una vicenda. Inoltre è importante gestire correttamente topi durante la procedura di infezione. Assicurarsi di posizionare i topi in una camera di anestesia privo di isoflurane. Topi panico se vengono inseriti in una camera che è stato pre-riemp...

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Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni nell'uomo. Un modello appropriato in vivo è fondamentale per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di nuove terapie. Con questo modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino, si può esaminare la patogenesi ed i nuovi trattamenti contro queste infezioni mortali.

Modello murino aspirazione orofaringea di polmonite batterica associata a ventilazione e acquisite in ospedale

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

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11.6K Views.  University of Southern California. Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni nell'uomo. Un modello appropriato in vivo è fondamentale per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di nuove terapie. Con questo modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino, si può esaminare la patogenesi ed i nuovi trattamenti contro queste infezioni mortali.

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Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Bioluminescent modello murino epatica Tumori

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

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Medicina

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

Trattamento manipolativo osteopatico come strumento aggiuntiva Utile per polmonite

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Un modello murino di emorragia subaracnoidea

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Infiammazione Modello di orofaringea candidosi in topi immunodeficienti

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Un modello murino di irreversibile e reversibile unilaterale Ureteric Ostruzione

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration (E-TTNA) for Sampling of Lung Nodules

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently available to sample nodules for pathological diagnosis. Those technologies can be divided into bronchoscopic and non-bronchoscopic interventions. Electromagnetic navigational bronchoscopy is being extensively used for the endobronchial approach to peripheral lung nodules but has been hindered by anatomic challenges resulting in a 70% diagnostic yield. Electromagnetic navigational guided transthoracic needle lung biopsy is novel non-bronchoscopic method that uses a percutaneous electromagnetic tip tracked needle to obtain core biopsy specimens. Electromagnetic navigational transthoracic needle aspiration complements bronchoscopic techniques potentially allowing the provider to maximize the diagnostic yield during one single procedure. This article describes a novel integrated diagnostic approach to pulmonary lung nodules. We propose the use of endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration (EBUS-TBNA) for mediastinal staging; radial EBUS, navigational bronchoscopy and E-TTNA during one single procedure to maximize diagnostic yield and minimize the number of invasive procedures needed to obtain a diagnosis. This manuscript describes in detail how the navigation transthoracic procedure is performed. Additional clinical studies are needed to determine the clinical utility of this novel technology.

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration E-TTNA for Sampling of Lung Nodules

We describe the novel use of electromagnetic navigational guided transthoracic needle aspiration for the pathologic assessment of human lung nodules.

L&#39;uso della navigazione elettromagnetica transtoracica Needle Aspiration (E-TTNA) per il campionamento di noduli polmonari

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modello murino aspirazione orofaringea di polmonite batterica associata a ventilazione e acquisite in ospedale

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