Este método puede ayudar a responder preguntas clave en epigenética y TET2 mediado 5-Methylcytosine demethylation field tales análisis de la actividad de mutaciones tet2 normales y clínicas. La principal ventaja de esta técnica es que el TET2 nativo se puede purificar en un solo paso, y su actividad se puede analizar en términos de formación de los tres productos. Varios estudiantes graduados demostrarán el procedimiento.
La purificación de proteínas será realizada por Chayan Bhattacharya, el ensayo TET2 de Aninda Sundary Dey y el análisis LC-MS/MS de Navid Ayon. Para la transformación bacteriana, añada un microlitro de vector de expresión de destino pDEST 14 recombinante que contenga dioxigenasa TET2 humana sin etiquetar a 100 microlitros de células E.coli BL21 DE3 químicamente competentes en un tubo de 1,7 mililitros. Después de la incubación en hielo durante al menos 15 minutos, impacte térmicamente la mezcla a 42 grados Celsius durante 30 segundos en un baño de agua.
Inmediatamente después del choque de calor, vuelva a colocar las células sobre hielo durante un mínimo de dos minutos. Después de esto, añadir 250 microlitros de caldo súper óptimo con represión catabolita a las células. Incubar las células bacterianas durante una hora a 37 grados centígrados en una coctelera.
Después de la incubación, gire hacia abajo las células centrifugando el tubo a 9.000 veces la gravedad durante un minuto. Deseche el 70% del sobrenadante por pipeteo, y disuelva el pellet en el medio restante. Extienda la suspensión celular sobre una placa de agar de caldo de Lirua que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina.
Incubar la placa durante 16 horas a 37 grados centígrados. Seleccione una colonia aislada e inocularla en 10 mililitros de medios de ampicilina LB. Incubar el tubo a 37 grados centígrados en una coctelera durante la noche.
Después de esto, utilizar 100 microlitros de cultivo bacteriano para inocular 100 mililitros de medios de ampicilina LB como un cultivo primario. Incubar el tubo a 37 grados centígrados en una coctelera durante la noche. Al día siguiente, inocular 15 matraces, cada uno con 600 mililitros de medios de ampicilina LB con seis mililitros de cultivo primario por matraz.
Incubar los matraces a 37 grados centígrados en una coctelera a 180 RPM. Para comprobar la densidad del cultivo bacteriano, mida su densidad óptica a 600 nanómetros, o OD600, utilizando un espectrofotómetro. Después de que el cultivo alcance una densidad de 0,8 en OD600, induzca la expresión de la proteína TET2 con 300 microlitros de un IPTG molar en cada matraz, y haga crecer el cultivo durante 16 horas adicionales a 17 grados centígrados.
Después de la incubación, transferir el cultivo bacteriano a botellas centrífugas. Centrifugar el cultivo bacteriano expresando la enzima TET2 a 5, 250 veces la gravedad durante 45 minutos. Utilice el pellet bacteriano para la purificación de TET2.
Trabajando en hielo o a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 100 mililitros de tampón MES de 50 mililitros, pH seis. Luego tome cinco mililitros de la suspensión celular, y llevarlo a 45 mililitros con el buffer. Sonicar la suspensión durante cinco veces 30 segundos a potencia 20, con intervalos de enfriamiento de 60 segundos.
Gire el izado a 5, 250 veces la gravedad durante 45 minutos. Recoger el sobrenadante que contiene la enzima TET2 soluble y pasarlo a través de filtros de 0,45 micras antes de cargar en un sistema FPLC. Empaquete 30 mililitros de una resina de intercambio catiónica fuerte en una columna FPLC.
Equilibre la columna con 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado a un caudal constante de 0,3 mililitros por minuto utilizando un sistema FPLC. Cargue el izado clarificado en la columna preequilibrada y lave con aproximadamente 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado hasta que el flujo se vuelva claro. Elute TET2 usando un gradiente de cero a 10% desde el búfer de lavado hasta el búfer de elución en 15 volúmenes de lecho, seguido de una retención en un búfer de elución del 10% para dos volúmenes de lecho.
Recoger 100 muestras de microlitro de analizo celular antes y después de la carga de la columna, junto con todas las fracciones de elución, y analizar en 10%resolviendo gel SDS-PAGE. Agrupa las fracciones que contienen proteína TET2 y seca la proteína. Luego disuelve la enzima en 10 mililitros de agua, y guárdalos a menos 80 grados Centígrados.
Realizar todas las reacciones de desmetilación en triplicado con tres microgramos de sustrato. Añadir 100 microgramos de enzima TET2 purificada a 50 microlitros de tampón de reacción total. Después de una hora de incubación a 37 grados, apagar las reacciones de oxidación catalizadas TET2 con cinco microlitros de EDTA de 500 milímetros.
Para preparar muestras para el análisis, separe el ADN de la mezcla de reacción TET2 añadiendo primero 100 microlitros de tampón de unión Oligo a 55 microlitros de reacción apagada. Después de esto, añadir 400 microlitros de 100% etanol a la mezcla. Pase esta mezcla a través de una columna de enlace Oligo.
Después de lavar el ADN enlazado con 750 microlitros de tampón de lavado, eluir el ADN en 20 microlitros de agua. Ahora, digiere el ADN aislado con dos unidades de DNase I y 60 unidades de nucleasa S1 a 37 grados Celsius durante 12 horas para producir monofosfatos de nucleósidos individuales. Después de la digestión, añadir dos unidades de fosfatasa alcalina intestinal de la pantorrilla a las muestras.
Incubar por una adición 12 horas a 37 grados Celsius para eliminar los grupos de fosfato terminal de los monofosfatos de nucleósidos, y obtener los nucleósidos. Preparar una solución de stock de 100 micromolares de todos los nucleósidos de citosina modificados, y las bases de ADN normales en agua de grado HPLC para el desarrollo del método LC-MS/MS. Optimice los parámetros de MS/MS dependientes de nucleósidos mediante la infusión de soluciones de stock de una en una en el espectrómetro de masas a un caudal de 10 microlitros por minuto en el modo de escaneo de MS mejorado.
Se pueden optimizar varios parámetros utilizando la función de optimización cuantitativa automatizada del software para cada nucleósido de ADN. En este punto, optimice los parámetros restantes para cada nucleósido de ADN utilizando la función de optimización cuantitativa manual del software en el modo de análisis de inyección de flujo. Ahora, optimice los parámetros de MS/MS dependientes de la fuente inyectando 10 microlitros de solución de stock utilizando un gradiente con un 25% de disolvente B a un caudal de 0,3 mililitros por minuto.
Para separar los ocho nucleósidos de ADN, realice cromatografía líquida como se detalla en el protocolo de texto en una columna C18. Por último, detecte y cuantifique todos los nucleósidos utilizando el método LC-MS/MS en curvas estándar. Dado que el dominio catalítico de TET2 tiene un punto isoeléctrico relativamente alto en comparación con la mayoría de las proteínas E.coli autóctonas, se desarrolló un proceso de purificación eficiente que utiliza una cromatografía de intercambio catiónico.
Esta purificación produjo una enzima TET2 superior al 90% pura en un solo paso. Con el fin de separar y cuantificar diferentes derivados de la desoxicimidina y las cuatro bases de ADN naturales que siguen a la reacción enzimática TET2, se optimizó un ensayo sensible basado en LC-MS/MS. Las curvas estándar se dibujaron utilizando diluciones en serie de una mezcla que contiene todos los nucleósidos.
Los resultados del método de cromatografía líquida MS/MS se muestran aquí. El método permite la separación y cuantificación de las cuatro bases normales de ADN, así como las cuatro bases de citosina modificadas. En este procedimiento experimental, describimos la clonación de dominio catalítico texoxigenasa TET2 humano sin etiqueta utilizando una técnica de recombinación específica del sitio y una expresión suficiente en un vector de destino en E. Coli.
Hemos purificado eficientemente la enzima TET2 sin etiquetar utilizando cromatografía de intercambio catiónica para producir más del 90% de pureza en un solo paso. Además, hemos desarrollado un nuevo método de cromatografía líquida para separar las cuatro bases normales de ADN y las cuatro bases de citosina modificadas. Para cuantificar los ocho nucleósidos de las reacciones catalizadas TET2, hemos acoplado nuestro método mejorado de cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem.
A continuación, se utilizó el ensayo sensible LC-MS/MS para determinar la actividad de la enzima TET2 humana recombinante sin etiquetar. El enfoque descrito aquí mejorará en gran medida la valoración de la dioxigenasa TET2 mutante y de tipo salvaje.
