Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в эпигенетике и TET2 опосредованном 5-метилцитозин деметиляционном поле такой анализ активности нормальных и клинических мутаций TET2. Основным преимуществом этой методики является то, что родной TET2 можно очистить за один шаг, а его активность можно проанализировать с точки зрения формирования всех трех продуктов. Несколько аспирантов будут демонстрировать процедуру.
Очистка белка будет проводиться Чаяном Бхаттачарья, анализом TET2 Аниндой Сундари Дей и анализом LC-MS/MS Навидом Айоном. Для бактериальной трансформации добавьте один микролитр рекомбинантного вектора экспрессии pDEST 14, содержащего нетегированное человеческое диоксигеназу TET2, в 100 микролитров химически компетентных клеток E.coli BL21 DE3 в 1,7 миллилитровой трубке. После инкубации на льду, по крайней мере 15 минут, тепло удар смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 30 секунд в водяной бане.
Сразу же после теплового удара поместите клетки обратно на лед в течение как минимум двух минут. После этого добавьте в клетки 250 микролитров супероптимальных бульонов с катаболитными репрессиями. Инкубировать бактериальные клетки в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию в шейкере.
После инкубации, спина вниз клетки центрифугирования трубки в 9000 раз тяжести в течение одной минуты. Отбросьте 70% супернатанта путем пипетки, и растворите гранулы в оставшихся средствах массовой информации. Распространение клеточной суспензии на пластине бульона Лируа, содержащей 100 микрограммов на миллилитр ампициллина.
Инкубировать пластину в течение 16 часов при 37 градусах по Цельсию. Выберите одну изолированную колонию и привите ее в 10 миллилитров Ампициллина. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в шейкере на ночь.
После этого используйте 100 микролитров бактериальной культуры для прививки 100 миллилитров ЛБ ампициллина в качестве основной культуры. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в шейкере на ночь. На следующий день прививают 15 колб, каждая из которых содержит 600 миллилитров ЛБ ампициллина с шестью миллилитров первичной культуры на колбу.
Инкубировать колбы при 37 градусах по Цельсию на шейкере при 180 об/мин. Чтобы проверить плотность бактериальной культуры, измерьте ее оптическую плотность на уровне 600 нанометров, или OD600, с помощью спектрофотометра. После того, как культура достигает плотности 0,8 на OD600, индуцировать выражение белка TET2 с 300 микролитров одного молара IPTG в каждой колбе, и развивать культуру в течение дополнительных 16 часов при 17 градусов по Цельсию.
После инкубации перенесите бактериальную культуру в центрифуги. Центрифуга бактериальной культуры, выражают фермент TET2 в 5, 250 раз тяжести в течение 45 минут. Используйте бактериальные гранулы для очистки TET2.
Работая на льду или при четырех градусах Цельсия, повторно приостанавливайте бактериальные гранулы в 100 миллилитров 50-миллимолярной буфера МЕС, рН шесть. Затем возьмите пять миллилитров подвески клетки, и довести его до 45 миллилитров с буфером. Sonicate подвески в течение пяти раз 30 секунд при мощности 20, с 60-секундным интервалом охлаждения.
Спин лисировать при 5, 250 раз тяжести в течение 45 минут. Соберите супернатант, содержащий растворимый фермент TET2, и перейдите через фильтры 0,45 микрона перед загрузкой на систему FPLC. Упакуйте 30 миллилитров сильной смолы обмена катиоций в столбец FPLC.
Equilibrate столбец с 10 объемами кровати буфера мытья при постоянной скорости потока 0,3 миллилитров в минуту с помощью системы FPLC. Загрузите уточненный лизайт на предварительно уравновешенный столбец и смойте приблизительно 10 объемами кровати буфера мытья до тех пор, пока протека не станет ясной. Elute TET2 с использованием нулевого до 10%-градиента от буфера стирки до буфера elution в 15 объемах кровати, а затем удержание на 10%elution буфер для двух объемов кровати.
Соберите 100 образцов микролитров лизата клеток до и после загрузки столбца, а также все фракции элюции и проанализируйте на 10%разрешающий гель SDS-PAGE. Бассейн фракций, содержащих белок TET2, и заморозить сухой белок. Затем растворите фермент в 10 миллилитров воды, и хранить при минус 80 градусов по Цельсию.
Выполните все реакции деметилирования в три раза с тремя микрограммами субстрата. Добавьте 100 микрограммов очищенного фермента TET2 в 50 микролитров общего буфера реакции. После одного часа инкубации при 37 градусах, утолить TET2 катализированные реакции окисления с пятью микролитерами 500-миллимолярной ЭДТА.
Чтобы подготовить образцы для анализа, отделяйте ДНК от реакционной смеси TET2, сначала добавляя 100 микролитров буфера связывания олиго в 55 микролитров затухают реакции. После этого добавьте в смесь 400 микролитров 100% этанола. Перейдите эту смесь через столбец связывания олиго.
После мытья связанной ДНК с помощью 750 микролитров буфера стирки, утехать ДНК в 20 микролитров воды. Теперь переварить изолированную ДНК с двумя единицами DNase I и 60 единиц ядра S1 при 37 градусах по Цельсию в течение 12 часов для производства отдельных нуклеозидных монофосфатов. После пищеварения добавьте в образцы две единицы щелочной фосфатазы кишечника.
Инкубировать для добавления 12 часов при 37 градусах по Цельсию, чтобы удалить терминальные фосфатные группы из нуклеозидных монофосфатов, и получить нуклеозиды. Для разработки метода LC-MS/MS приготовьте 100-микромоляное решение всех модифицированных нуклеозидов цитозина и нормальные базы ДНК в воде класса HPLC. Оптимизация параметров MS/MS, зависящих от нуклеозида, путем вливая фондовые решения по одному в масс-спектрометре со скоростью потока 10 микролитров в минуту в расширенном режиме сканирования MS.
Несколько параметров могут быть оптимизированы с помощью автоматизированной функции количественной оптимизации программного обеспечения для каждого нуклеозида ДНК. На этом этапе оптимизируйте оставшиеся параметры для каждого нуклеозида ДНК, используя ручную функцию количественной оптимизации программного обеспечения в режиме анализа впрыска потока. Теперь оптимизируйте параметры MS/MS, зависящие от источника, путем впрыскивания 10 микролитров биржевого раствора с использованием градиента с 25%solvent B при скорости потока 0,3 миллилитров в минуту.
Чтобы отделить все восемь нуклеозидов ДНК, выполните жидкую хроматографию, описанную в текстовом протоколе на столбце C18. Наконец, обнаружение и количественная оценка всех нуклеозидов с использованием метода LC-MS/MS в стандартных кривых. Так как каталитическая область TET2 имеет относительно высокую изоэлектрическую точку по сравнению с большинством местных белков E.coli, был разработан эффективный процесс очистки с использованием хроматографии обмена катиоцией.
Эта очистка дала более 90%чистого фермента TET2 за один шаг. Для того, чтобы отделить и количественно различных производных дезоксицитидина и четырех естественных оснований ДНК после энзиматической реакции TET2, чувствительный LC-MS / MS основе анализа была оптимизирована. Стандартные кривые были нарисованы с использованием серийных разбавлений смеси, содержащей все нуклеозиды.
Результаты жидкой хроматографии MS/MS метод показаны здесь. Метод позволяет разметь и количественно оценить четыре нормальные основания ДНК, а также четыре модифицированных основания цитозина. В этой экспериментальной процедуре мы описываем клонирование нетегированного человеческого каталитического домена TET2 dioxynase с использованием метода рекомбинации, специфичного для сайта, и достаточного выражения вектора назначения в E.Coli.
Мы эффективно очищали нетегемый фермент TET2, используя хроматографию каного обмена, чтобы дать более 90% чистоты за один шаг. Кроме того, мы разработали новый метод жидкой хроматографии, чтобы отделить четыре нормальных основания ДНК и четыре модифицированных основания цитозина. Для количественной оценки восьми нуклеозидов катализированных реакций TET2 мы объединили наш усовершенствованный метод жидкой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией.
Чувствительный анализ LC-MS/MS был затем использован для определения активности рекомбинантного нетегированного человеческого фермента TET2. Описанный здесь подход значительно повысит оценку диоксигеназы дикого типа и мутанта TET2.
