この方法は、正常および臨床的なTET2突然変異の活性の分析のようなエピジェネティクスおよびTET2媒介した5-メチルシトシン脱メチル化分野における主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ネイティブTET2を一段階で精製することができ、その活性は、すべての3つの製品の形成の観点から分析することができるということです。数人の大学院生がこの手続きをデモンストレーションします。
タンパク質の精製は、チャヤン・バタタリヤ、アニンダ・サンデー・デイによるTET2アッセイ、ナビッド・アヨンによるLC-MS/MS分析によって行われます。細菌変換のために、1.7ミリリットルチューブ内の化学的に有能な大腸菌BL21 DE3細胞の100マイクロリットルにタグなしヒトTET2ジオキシゲナーゼを含む組換えpDEST 14終点発現ベクターを1マイクロリットル加えます。氷上で少なくとも15分間インキュベーションした後、水浴で30秒間摂氏42度で熱ショックを受ける。
ヒートショックの直後に、細胞を氷の上に2分間置きます。これに続いて、細胞にカタボライト抑制と超最適なスープの250マイクロリットルを追加します。シェーカーで37°Cで1時間細菌細胞をインキュベートします。
インキュベーション後、チューブを9,000倍の重力で1分間遠心して細胞を回転させます。ピペット処理により上清の70%を廃棄し、残りの培地にペレットを溶解する。1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含むリルアスープ寒天プレート上に細胞懸濁液を広げます。
プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。1つの孤立したコロニーを選択し、LBアンピシリン培地の10ミリリットルにそれを接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。
これに続いて、100マイクロリットルの細菌培養液を使用して、100ミリリットルのLBアンピシリン培地を一次培養物として接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。翌日、15個のフラスコを接種し、それぞれ600ミリリットルのLBアンピシリン培地を含み、フラスコ当たり6ミリリットルの一次培養液を含有する。
180 RPMのシェーカーで37°Cでフラスコをインキュベートします。細菌培養の密度を確認するには、分光光度計を使用して、600ナノメートル(OD600)で光学密度を測定します。培養がOD600で0.8の密度に達した後、各フラスコに1モルIPTGの300マイクロリットルでTET2タンパク質の発現を誘導し、さらに17°Cで培養を16時間培養する。
インキュベーションに続いて、細菌培養物を遠心分離機ボトルに移す。遠心分離機は、TET2酵素を5で発現する細菌培養物を、45分間重力の250倍にする。TET2精製用の細菌ペレットを使用してください。
氷または摂氏4度で作業し、細菌ペレットを50ミリモルMESバッファーの100ミリリットル、pH 6に再懸濁させる。その後、細胞懸濁液を5ミリリットル服用し、バッファーで45ミリリットルにします。サスペンションをパワー20で30秒間5回、60秒の冷却間隔で超音波処理します。
5、250倍の重力で45分間回転させます。可溶性TET2酵素を含む上清を収集し、FPLCシステムにロードする前に0.45ミクロンフィルターを通過させます。30ミリリットルの強いカチネーション交換樹脂をFPLCカラムに詰めます。
FPLCシステムを使用して、1分間0.3ミリリットルの一定の流量で10床の洗浄バッファーでカラムを平衡化します。明確化したライセートを事前平衡カラムに積み込み、フロースルーが明らかになるまで約10床の洗浄バッファで洗浄します。15床の容積の洗浄緩衝液から溶出バッファーへのゼロから10%の勾配を使用してElute TET2、2つのベッド容積のための10%溶出緩衝液での保持が続く。
カラムローディング前後の細胞溶解物の100マイクロリットルサンプルを、すべての溶出画分と共に収集し、10%解決SDS-PAGEゲルで分析します。TET2タンパク質を含む分画をプールし、タンパク質を凍結乾燥させる。その後、10ミリリットルの水に酵素を溶解し、マイナス80度で保存します。
3マイクログラムの基質を用いて三重化中のすべての脱メチル化反応を行います。精製されたTET2酵素の100マイクログラムを総反応バッファーの50マイクロリットルに加えます。37度で1時間のインキュベーションの後、500ミリモルEDTAの5マイクロリットルでTET2触媒酸化反応をクエンチ。
分析用のサンプルを調製するために、最初に55マイクロリットルのクエンチ反応にオリゴ結合バッファーの100マイクロリットルを加えることによってTET2反応混合物からDNAを分離する。これに続いて、混合物に100%エタノールの400マイクロリットルを加える。この混合物をオリゴ結合列に通します。
結合したDNAを750マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄した後、20マイクロリットルの水でDNAを溶出させる。今度は、DNase Iの2単位と摂氏37度のS1ヌクレアーゼの60単位で単離されたDNAを12時間消化し、個々のヌクレオシド一リン酸を生成する。消化後、サンプルに2単位の子牛腸管アルカリホスファターゼを加える。
37°Cで12時間加えて、ヌクレオシド一リン酸から末端リン酸基を除去し、ヌクレオシドを得る。LC-MS/MS法の開発のために、すべての修飾シトシンヌクレオシドの100マイクロモルストック溶液と、HPLCグレードの水中の正常なDNA塩基を調製します。拡張 MS スキャン モードで 1 分間に 10 マイクロリットルの流量で質量分析計にストックソリューションを 1 つずつ注入することにより、ヌクレオシド依存 MS/MS パラメータを最適化します。
いくつかのパラメータは、各DNAヌクレオシドのソフトウェアの自動定量最適化機能を使用して最適化することができます。この時点で、フローインジェクション解析モードのソフトウェアの手動定量的最適化機能を使用して、DNAヌクレオシドごとに残りのパラメータを最適化します。現在では、1分間に0.3ミリリットルの流量で25%の溶媒Bの勾配を使用して10マイクロリットルのストック溶液を注入することで、ソース依存MS/MSパラメータを最適化します。
8つのDNAヌクレオシドをすべて分離するには、C18カラムのテキストプロトコルに詳述されているように液体クロマトグラフィーを実行します。最後に、LC-MS/MS法を標準曲線で使用して、全てのヌクレオシドを検出し、定量化します。TET2の触媒ドメインは、ほとんどの先住民族の大腸菌タンパク質と比較して比較的高い等電点を有するため、カチオン交換クロマトグラフィーを利用した効率的な精製プロセスが開発された。
この精製は、単一のステップで90%以上の純粋なTET2酵素を生み出した。異なるデオキシシチジン誘導体とTET2酵素反応に続く4つの天然DNA塩基を分離および定量化するために、感度の高いLC-MS/MSベースのアッセイを最適化しました。標準曲線は、全てのヌクレオシドを含む混合物の連続希釈を用いて描かれた。
液体クロマトグラフィー MS/MS 法の結果を以下に示します。この方法は、4つの正常DNA塩基と、4つの修飾されたシトシン塩基の分離および定量化を可能にする。本実験手順では、部位特異的組換え技術を用いたタグなしヒトTET2ジオキシナーゼ触媒ドメインのクローニングと、大腸菌における標的ベクターにおける十分な発現について説明する。
カチ換算クロマトグラフィーを利用したタグなしTET2酵素を効率よく精製し、1回の工程で90%以上の純度を得た。また、4つの正常DNA塩基と4つの修飾シトシン塩基を分離する新規液体クロマトグラフィー法を開発しました。TET2触媒反応から8つのヌクレオシドを定量化するために、改善された液体クロマトグラフィー法とタンデム質量分析法を組み合わせた。
その後、感受性LC-MS/MSアッセイを利用して、組み換え非タグ化ヒトTET2酵素の活性を決定した。ここで説明するアプローチは、野生型および変異型TET2ジオキシゲナーゼの評価を大幅に高める。
