שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח אפיגנטיקה TET2 מתווך 5-Methylcytosine demethylation שדה כזה ניתוח של פעילות של מוטציות TET2 נורמלי וקליני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי TET2 יליד ניתן לטהר בשלב אחד, ואת פעילותה ניתן לנתח במונחים של היווצרות של כל שלושת המוצרים. מספר סטודנטים לתארים מתקדמים יפגינו את ההליך.
טיהור החלבון יתבצע על ידי Chayan Bhattacharya, ההסתערות TET2 על ידי אנינדה Sundary Dey, וניתוח LC-MS /MS על ידי נאביד Ayon. עבור טרנספורמציה חיידקית, להוסיף מיקרוליטר אחד של רקומביננטי pDEST 14 וקטור ביטוי היעד המכיל דיוקסיגנאאז TET2 אנושי לא מתויג ל 100 microliters של תאי E.coli BL21 DE3 מוכשרים כימית בצינור 1.7 מיליליטר. לאחר הדגירה על הקרח במשך 15 דקות לפחות, החום מזעזע את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות באמבט מים.
מיד לאחר הלם חום, מניחים את התאים בחזרה על הקרח למשך שתי דקות לפחות. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט לתאים. דגירה התאים החיידקיים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר.
לאחר הדגירה, לסובב את התאים על ידי צנטריפוגה הצינור ב 9, 000 פעמים כוח הכבידה לדקה אחת. השלך 70% מהעל-טבעי על-ידי צינורות, והמס את גלולת הכדור במדיה הנותרת. מורחים את ההשעיה התא על צלחת אגר מרק Lirua המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.
דגירה הצלחת במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בחר מושבה מבודדת אחת, וחסן אותה לתוך 10 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר לילה.
בעקבות זאת, להשתמש 100 microliters של תרבות החיידקים כדי לחסן 100 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB כתרבות ראשונית. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר לילה. למחרת, לחסן 15 בקבוקונים, כל אחד מכיל 600 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB עם שישה מיליליטר של התרבות העיקרית לכל בקבוק.
דגירה flasks ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 180 סל"ד. כדי לבדוק את הצפיפות של תרבות החיידקים, למדוד את הצפיפות האופטית שלה ב 600 ננומטר, או OD600, באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר שהתרבות מגיעה לצפיפות של 0.8 ב- OD600, יש לגרום לביטוי של חלבון TET2 עם 300 מיקרוליטרים של IPTG טוחן אחד בכל בקבוקון, ולגדל את התרבות למשך 16 שעות נוספות ב-17 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, מעבירים את תרבות החיידקים לבקבוקי צנטריפוגה. צנטריפוגה התרבות החיידקית המבטאת את האנזים TET2 ב 5, 250 פעמים כבידה במשך 45 דקות. השתמש גלולה חיידקי לטיהור TET2.
עובד על קרח או בארבע מעלות צלזיוס, להשעות מחדש את גלולת החיידקים ב 100 מיליליטר של חיץ MES 50 מילימולאר, pH שש. ואז לקחת חמישה מיליליטר של ההשעיה התא, ולהביא אותו ל45 מיליליטר עם החיץ. Sonicate ההשעיה במשך חמש פעמים 30 שניות בחשמל 20, עם מרווחי קירור 60 שניות.
לסובב את lysate ב 5, 250 פעמים כבידה במשך 45 דקות. לאסוף את supernatant המכיל את האנזים TET2 מסיס, ולהעביר אותו דרך מסנני 0.45 מיקרון לפני טעינה על מערכת FPLC. לארוז 30 מיליליטר של שף חילופי קטיונים חזק לתוך עמודת FPLC.
לצייד את העמוד עם 10 נפחי מיטה של חיץ לשטוף בקצב זרימה קבוע של 0.3 מיליליטר לדקה באמצעות מערכת FPLC. טוענים את התמיסה המובהרת על העמודה המופחתת מראש, ושוטפים בכ-10 כרכים של חיץ שטיפה עד שהזרימה הופכת ברורה. Elute TET2 באמצעות אפס עד 10% הדרגתי ממאגר הכביסה למאגר האלוטיון בנפחי 15 מיטות, ואחריו אחיזה במאגר של 10%elution עבור שני אמצעי אחסון של מיטות.
לאסוף 100 דגימות microliter של lysate התא לפני ואחרי טעינת עמודה, יחד עם כל שברי elution, ולנתח על 10%פתרון SDS-PAGE ג'ל. בריכת שברים המכילים חלבון TET2, להקפיא לייבש את החלבון. ואז להמיס את האנזים ב 10 מיליליטר של מים, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
בצע את כל התגובות demethylation ב טריפליקט עם שלושה מיקרוגרם של מצע. הוסף 100 מיקרוגרם של אנזים TET2 מטוהר ל 50 microliters של מאגר התגובה הכולל. לאחר דגירה של שעה אחת ב-37 מעלות, הרוו את תגובות החמצון הממוזערות של TET2 עם חמישה מיקרוליטרים של EDTA 500 מילימולרי.
כדי להכין דגימות לניתוח, להפריד את ה-DNA מתערובת התגובה TET2 על ידי הוספת תחילה 100 microliters של מאגר מחייב אוליגו ל 55 microliters של תגובה מרווה. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של 100% אתנול לתערובת. מעבירים את התערובת דרך עמודת כריכת אוליגו.
לאחר שטיפת הדנ"א הכבול עם 750 מיקרוליטרים של חיץ כביסה, יש לחמק מהדנ"א ב-20 מיקרוליטרים של מים. עכשיו, לעכל את ה-DNA מבודד עם שתי יחידות של DNase אני ו 60 יחידות של נוקלאאז S1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות כדי לייצר מונופוספטים נוקליאוסיד בודדים. לאחר העיכול, להוסיף שתי יחידות של פוספטזה אלקליין מעיים עגל לדגימות.
דגירה לתוספת של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את קבוצות פוספט מסוף מן מונופוספטים nucleoside, ולקבל את הנוקלאוזידים. הכן פתרון מלאי של 100 מיקרומולרים של כל גרעיני הציטוסין ששונו, ואת בסיסי הדנ"א הרגילים במים ברמת HPLC לפיתוח שיטת LC-MS/MS. מטב את הפרמטרים MS/MS התלויים בגרעין על-ידי החדרת פתרונות מלאי בזה אחר זה בספקטרומטר המסה בקצב זרימה של 10 מיקרוליטרים לדקה במצב סריקת טרשת נפוצה משופרת.
ניתן לייעל מספר פרמטרים באמצעות תכונת האופטימיזציה הכמותית האוטומטית של התוכנה עבור כל גרעין DNA. בשלב זה, לייעל את הפרמטרים הנותרים עבור כל nucleoside DNA באמצעות תכונת אופטימיזציה כמותית ידנית של התוכנה במצב ניתוח הזרקת זרימה. כעת, מטב פרמטרי MS/MS תלויי מקור על-ידי הזרקת 10 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי באמצעות שיפוע עם 25% ממס B בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה.
כדי להפריד את כל שמונת נוקלאוזידים DNA, לבצע כרומטוגרפיה נוזלית כמפורט בפרוטוקול הטקסט בעמודה C18. לבסוף, לזהות ולכרות את כל הגרעינים באמצעות שיטת LC-MS/MS בעקומות סטנדרטיות. מאז התחום הקטאליטי של TET2 יש נקודה איסואלקטרית גבוהה יחסית בהשוואה לרוב החלבונים הילידים E.coli, תהליך טיהור יעיל ניצול כרומטוגרפיה חילופי קטיון פותחה.
טיהור זה הניב יותר מ 90% אנזים TET2 טהור בשלב אחד. על מנת להפריד ולכומת נגזרות deoxycytidine שונות וארבעת בסיסי ה- DNA הטבעיים בעקבות התגובה האנזימטית TET2, LC-MS / MS רגיש מבוסס חקירה היה אופטימיזציה. עקומות סטנדרטיות צוירו באמצעות דילול סדרתי של תערובת המכילה את כל הנוקלאוזידים.
תוצאות שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית MS/MS מוצגות כאן. השיטה מאפשרת הפרדה וכימות של ארבעת בסיסי הדנ"א הרגילים, כמו גם ארבעת בסיסי הציטוסין ששונו. בהליך ניסיוני זה, אנו מתארים את השיבוט של תחום קטליטי TET2 dioxynase אנושי לא מתויג באמצעות טכניקת קומבינציה ספציפית לאתר וביטוי מספיק בווקטור יעד ב- E.Coli.
טיהרנו ביעילות אנזים TET2 לא מתויג תוך שימוש בכרומטוגרפיה של חילופי קיט כדי להניב יותר מ-90% טוהר בשלב אחד. יתר על כן, פיתחנו שיטת כרומטוגרפיה נוזלית חדשנית כדי להפריד בין ארבעת בסיסי הדנ"א הרגילים וארבעת בסיסי הציטוסין ששונו. כדי לכמת את שמונת הנוקלאוזידים מתגובות קטליזציה TET2, יש לנו יחד עם שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית המשופרת שלנו עם ספקטרומטריית מסת טנדם.
LC-MS/ MS רגיש assay היה אז מנוצל כדי לקבוע את הפעילות של אנזים TET2 אנושי רקומביננטי לא מתויג. הגישה המתוארת כאן תשפר מאוד את הערכת השווי של סוג פראי מוטנט TET2 דיוקסיגנאז.
