Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in epigenetica e tet2 mediato campo di demetilazione 5-metilcitosina tale analisi dell'attività delle mutazioni TET2 normali e cliniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il TET2 nativo può essere purificato in un unico passaggio e la sua attività può essere analizzata in termini di formazione di tutti e tre i prodotti. Diversi laureati diranno la procedura.
La purificazione delle proteine sarà eseguita da Chayan Bhattacharya, il saggio TET2 di Aninda Sundary Dey e l'analisi LC-MS/MS di Navid Ayon. Per la trasformazione batterica, aggiungere un microlitro di vettore di espressione di destinazione pDEST 14 ricombinante contenente TET2 diossigenasi umana non registrata a 100 microlitri di cellule E.coli BL21 DE3 chimicamente competenti in un tubo da 1,7 millilitri. Dopo l'incubazione sul ghiaccio per almeno 15 minuti, scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi in un bagno d'acqua.
Immediatamente dopo lo shock termico, riposizionare le cellule sul ghiaccio per un minimo di due minuti. In seguito, aggiungi 250 microlitri di brodo super ottimale con la repressione dei cataboliti alle cellule. Incubare le cellule batteriche per un'ora a 37 gradi Celsius in uno shaker.
Dopo l'incubazione, spingi le cellule centrifugando il tubo a 9.000 volte la gravità per un minuto. Scartare il 70% del supernatante con la pipettazione e sciogliere il pellet nel supporto rimanente. Stendere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo Lirua contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro.
Incubare la piastra per 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una colonia isolata e inocularla in 10 millilitri di mezzi di ampicillina LB. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte.
In seguito, utilizzare 100 microlitri di coltura batterica per inoculare 100 millilitri di mezzi di ampicillina LB come coltura primaria. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte. Il giorno successivo, inoculare 15 mastri, ognuno contenente 600 millilitri di mezzi di ampicillina LB con sei millilitri di coltura primaria per pallone.
Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius su uno shaker a 180 giri/min. Per controllare la densità della coltura batterica, misurare la sua densità ottica a 600 nanometri, o OD600, usando uno spettrofotometro. Dopo che la coltura raggiunge una densità di 0,8 a OD600, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 microlitri di un IPTG molare in ogni pallone e far crescere la coltura per altre 16 ore a 17 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, trasferire la coltura batterica in bottiglie di centrifuga. Centrifugare la coltura batterica esprimendo l'enzima TET2 a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Utilizzare il pellet batterico per la purificazione TET2.
Lavorando sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius, sospendere di nuovo il pellet batterico in 100 millilitri di tampone MES da 50 millimolare, pH sei. Quindi prendere cinque millilitri della sospensione cellulare e portarlo a 45 millilitri con il tampone. Sonicare la sospensione per cinque volte 30 secondi a potenza 20, con intervalli di raffreddamento di 60 secondi.
Ruotare il lysate a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Raccogliere il supernatante contenente l'enzima TET2 solubile e passarlo attraverso filtri da 0,45 micron prima di caricarlo su un sistema FPLC. Imballare 30 millilitri di una forte resina scambiata di cationi in una colonna FPLC.
Equilibrare la colonna con 10 volumi di tampone di lavaggio alla portata costante di 0,3 millilitri al minuto utilizzando un sistema FPLC. Caricare il llysate chiarificato sulla colonna pre-equilibrata e lavare con circa 10 volumi di letto di tampone di lavaggio fino a quando il flusso non diventa chiaro. Elute TET2 con una sfumatura da zero a 10% dal buffer di lavaggio al buffer di eluizione in 15 volumi di letto, seguito da un blocco al buffer di eluizione del 10% per due volumi di letto.
Raccogliere 100 campioni di microliter di lisato cellulare prima e dopo il caricamento della colonna, insieme a tutte le frazioni di eluizione, e analizzare sul gel SDS-PAGE risolutivo al 10%. Mettere in comune le frazioni contenenti proteine TET2 e congelare la proteina. Quindi sciogliere l'enzima in 10 millilitri di acqua e conservare a meno 80 gradi Celsius.
Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con tre microgrammi di substrato. Aggiungere 100 microgrammi di enzima TET2 purificato a 50 microlitri di tampone di reazione totale. Dopo un'ora di incubazione a 37 gradi, dissetare le reazioni di ossidazione catalizzate da TET2 con cinque microlitri di EDTA da 500 millimolari.
Per preparare campioni per l'analisi, separare il DNA dalla miscela di reazione TET2 aggiungendo prima 100 microlitri di tampone di legame Oligo a 55 microlitri di reazione temprato. In seguito, aggiungere 400 microlitri di 100% di etanolo alla miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di legame Oligo.
Dopo aver lavato il DNA legato con 750 microlitri di tampone di lavaggio, elutare il DNA in 20 microlitri di acqua. Ora, digerire il DNA isolato con due unità di DNA I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 gradi Celsius per 12 ore per produrre singoli monofosfati nucleoside. Dopo la digestione, aggiungere due unità di fosfatasi alcalina intestinale del polpaccio ai campioni.
Incubare per un'aggiunta di 12 ore a 37 gradi Celsius per rimuovere i gruppi fosfatici terminali dai monofosfati nucleoside e ottenere i nucleosidi. Preparare una soluzione di stock di 100 micromolari di tutti i nucleosidi citosina modificati e le normali basi di DNA in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS. Ottimizzare i parametri MS/MS nucleoside-dipendenti infondendo soluzioni stock una alla volta nello spettrometro di massa a una portata di 10 microlitri al minuto in modalità di scansione MS avanzata.
Diversi parametri possono essere ottimizzati utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa automatizzata del software per ogni nucleoside del DNA. A questo punto, ottimizzare i parametri rimanenti per ogni nucleoside del DNA utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa manuale del software in modalità di analisi dell'iniezione di flusso. Ora, ottimizza i parametri MS/MS dipendenti dalla sorgente iniettando 10 microlitri di soluzione stock utilizzando un gradiente con il 25% di solvente B a una portata di 0,3 millilitri al minuto.
Per separare tutti e otto i nucleosidi del DNA, eseguire la cromatografia liquida come descritto nel protocollo di testo su una colonna C18. Infine, rilevare e quantificare tutti i nucleosidi utilizzando il metodo LC-MS/MS nelle curve standard. Poiché il dominio catalitico del TET2 ha un punto isoelettrico relativamente alto rispetto alla maggior parte delle proteine indigene E.coli, è stato sviluppato un efficiente processo di purificazione che utilizza una cromatografia a scambio di cationi.
Questa purificazione ha prodotto un enzima TET2 puro superiore al 90% in un unico passaggio. Al fine di separare e quantificare diversi derivati della deossicitidina e le quattro basi naturali di DNA a seguito della reazione enzimatica TET2, è stato ottimizzato un saggio sensibile a base di LC-MS/MS. Le curve standard sono state disegnate utilizzando diluizioni seriali di una miscela contenente tutti i nucleosidi.
I risultati della cromatografia liquida metodo MS/MS sono mostrati qui. Il metodo consente la separazione e la quantificazione delle quattro normali basi di DNA, così come delle quattro basi di citosina modificate. In questa procedura sperimentale, descriviamo la clonazione di dominio catalitico tet2 umano senza ostazioni utilizzando la tecnica di ricombinazione specifica del sito e un'espressione sufficiente in un vettore di destinazione in E.Coli.
Abbiamo purificato in modo efficiente l'enzima TET2 non registrato utilizzando la cromatografia a scambio di cationi per produrre una purezza superiore al 90% in un unico passaggio. Inoltre, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di cromatografia liquida per separare le quattro normali basi di DNA e le quattro basi di citosina modificate. Per quantificare gli otto nucleosidi delle reazioni catalizzate da TET2, abbiamo accoppiato il nostro metodo di cromatografia liquida migliorato con la spettrometria di massa tandem.
Il saggio sensibile LC-MS/MS è stato quindi utilizzato per determinare l'attività dell'enzima TET2 umano non appiccato ricombinante. L'approccio qui descritto migliorerà notevolmente la valutazione della tet2 diossigenasi di tipo selvatico e mutante.
