이 방법은 후성 유전학 및 TET2 중재 5-메틸 시토신 demethylation 분야에서 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 될 수 있습니다 정상 및 임상 TET2 돌연변이의 활동의 이러한 분석. 이 기술의 주요 장점은 네이티브 TET2가 한 단계로 정제될 수 있고, 그 활동은 세 가지 제품의 형성 측면에서 분석될 수 있다는 것이다. 몇몇 대학원생은 절차를 시연할 것입니다.
단백질 정제는 아닌다 순다리 데이의 TET2 분석, Navid Ayon의 LC-MS/MS 분석에 의해 수행됩니다. 세균 성 변형을 위해, 1.7 밀리리터 튜브에 화학적으로 유능한 E.coli BL21 DE3 세포의 100 마이크로 리터에 태그가 없는 인간 TET2 디산소아제를 포함하는 재조합 pDEST 14 대상 발현 벡터의 마이크로리터 1개를 첨가한다. 얼음에 잠복한 후 적어도 15분 동안, 열은 수조에서 30초 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 충격에 빠뜨림.
열 충격 직후, 세포를 얼음에 다시 2분 동안 놓습니다. 이에 따라, 세포에 이타볼라이트 억압을 가진 250마이크로리터의 초최적의 국물을 첨가하십시오. 셰이커에서 섭씨 37도에서 세균 세포를 1 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 튜브를 원심분리하여 1분 동안 000배의 중력을 원심분리하여 세포를 회전시합니다. 피펫팅으로 상체의 70%를 버리고 나머지 매체에 펠릿을 용해합니다. 릴리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 Lirua 국물 한마고 접시에 세포 현탁액을 퍼뜨리는 다.
섭씨 37도에서 16시간 동안 접시를 배양합니다. 하나의 고립 된 식민지를 선택하고 LB 암피실린 미디어의 10 밀리리터로 접종하십시오. 하룻밤 사이에 37도에서 튜브를 배양하십시오.
이에 따라, 100 마이크로리터의 세균 배양을 사용하여 LB 암피실린 배지의 100밀리리터를 1차 배양으로 접종한다. 하룻밤 사이에 37도에서 튜브를 배양하십시오. 다음 날, 15 플라스크, 각각 포함 600 LB 암피실린 미디어의 밀리리터 와 6 플라스크 당 기본 문화의 밀리리터.
180 RPM에서 셰이커에 섭씨 37도에서 플라스크를 배양하십시오. 세균 배양의 밀도를 확인하려면 분광계를 사용하여 600 나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정합니다. 배양후 OD600에서 0.8의 밀도에 도달한 후, 각 플라스크에서 1개의 어금니 IPTG의 300마이크로리터를 가진 TET2 단백질의 발현을 유도하고, 섭씨 17도에서 16시간 동안 배양을 추가로 성장시한다.
인큐베이션에 따라 세균 배양을 원심분리기 병으로 옮기. TET2 효소를 5, 250배의 중력으로 45분 동안 발현하는 세균 배양을 원심분리합니다. TET2 정제를 위해 세균 펠릿을 사용하십시오.
얼음 또는 섭씨 4도에서 작업, 50 밀리머 MES 버퍼의 100 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단, pH 6. 그런 다음 셀 서스펜션의 5 밀리리터를 가져 와서 버퍼가있는 45 밀리리터로 가져 올 수 있습니다. 60초 냉각 간격으로 전원 20에서 서스펜션을 5회 30초 동안 초음파 처리합니다.
45분 동안 5, 250배의 중력으로 용해를 회전시다. 용해성 TET2 효소를 함유한 상체를 수집하고 FPLC 시스템에 적재하기 전에 0.45 미크론 필터를 통과합니다. 강력한 양이온 교환 수지 30밀리리터를 FPLC 열로 포장합니다.
FPLC 시스템을 사용하여 분당 0.3 밀리리터의 일정한 유량으로 10개의 침대 볼륨의 세척 버퍼로 컬럼을 상화합니다. 명확한 리자이트를 미리 평형 컬럼에 적재하고, 유동이 명확해질 때까지 약 10개의 침대 부피의 세척 버퍼로 세척합니다. Elute TET2는 세척 버퍼에서 15개의 침대 볼륨에서 용출 버퍼로 0~ 10%의 그라데이션을 사용하고, 두 개의 침대 볼륨에 대해 10%의 용출 버퍼에서 홀드를 제공합니다.
모든 용출 분획과 함께 열 로딩 전후에 셀 용액 100 마이크로리터 샘플을 수집하고 SDS-PAGE 젤을 10% 분해하여 분석합니다. TET2 단백질을 함유한 분수를 풀링하고 단백질을 동결건조시합니다. 그런 다음 효소를 10 밀리리터의 물에 녹여 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
기판의 3 마이크로그램으로 삼중화물에 있는 모든 demethylation 반응을 수행합니다. 정제된 TET2 효소 100마이크로그램을 총 반응 버퍼 50마이크로리터에 추가합니다. 37도에서 1 시간 배양 후, 500 밀리알러 EDTA의 5 마이크로 리터와 TET2 촉매 산화 반응을 담금질.
분석을 위해 샘플을 준비하기 위해, 먼저 담금질 반응의 55 마이크로 리터에 Oligo 결합 완충제의 100 마이크로 리터를 추가하여 TET2 반응 혼합물에서 DNA를 분리합니다. 이에 따라 혼합물에 100%에탄올의 400마이크로리터를 첨가한다. 이 혼합물을 올리고 바인딩 컬럼을 통과합니다.
750 마이크로리터의 세척 완충제로 결합 된 DNA를 세척 한 후 20 마이크로 리터의 물에 DNA를 엘로트하십시오. 지금, 개별 뉴클레오시드 단인산염을 생성하기 위하여 12 시간 동안 37섭씨에서 DNase I및 S1 핵제의 60 단위의 2개의 단위로 고립된 DNA를 소화합니다. 소화 후, 샘플에 종아리 내장 알칼리 인산염의 두 단위를 추가합니다.
37°C에서 추가 12시간 동안 인산염을 제거하여 뉴클레오사이드 단인산염으로부터 종자 인산염군을 제거하고 뉴클레오시드를 획득한다. 모든 수정된 사이토신 뉴클레오시드의 100 마이크로몰라 스톡 용액을 준비하고, LC-MS/MS 방법의 개발을 위해 HPLC 급 수에서 정상 DNA 염기를 제조한다. 향상된 MS 스캔 모드에서 분당 10 마이크로리터의 유속도로 질량 분광계에서 한 번에 하나씩 스톡 솔루션을 주입하여 뉴클레오시드 에 의존하는 MS/MS 파라미터를 최적화합니다.
여러 파라미터는 각 DNA 뉴클레오시드에 대한 소프트웨어의 자동화된 정량 최적화 기능을 사용하여 최적화될 수 있다. 이 시점에서, 유동 분사 분석 모드에서 소프트웨어의 수동 정량 최적화 기능을 사용하여 각 DNA 뉴클레오시드에 대한 나머지 파라미터를 최적화한다. 이제 분당 0.3 밀리리터의 유량으로 25%의 용매 B를 사용한 그라데이션을 사용하여 10마이크로리터의 스톡 솔루션을 주입하여 소스 에 의존하는 MS/MS 매개변수를 최적화합니다.
8개의 DNA 뉴클레오시드를 모두 분리하려면 C18 컬럼의 텍스트 프로토콜에 상세한 바와 같이 액체 크로마토그래피를 수행한다. 마지막으로, 표준 곡선에서 LC-MS/MS 방법을 사용하여 모든 뉴클레오시드를 검출하고 정량화합니다. TET2의 촉매 영역은 대부분의 토착 대장균 단백질과 비교하여 상대적으로 높은 동전점을 가지므로 양이온 교환 크로마토그래피를 활용한 효율적인 정제 과정이 개발되었다.
이 정제는 한 단계에서 90% 이상의 순수 TET2 효소를 산출했습니다. TET2 효소 반응에 따라 상이한 디옥시티딘 유도체와 4개의 천연 DNA 베이스를 분리및 정량화하기 위해 민감한 LC-MS/MS 기반 분석이 최적화되었다. 표준 곡선은 모든 뉴클레오시드를 포함하는 혼합물의 직렬 희석을 사용하여 그려졌습니다.
액체 크로마토그래피 MS/MS 방법의 결과는 여기에 나와 있다. 이 방법은 4개의 정상 DNA 기지뿐만 아니라 4개의 수정된 사이토신 염기의 분리 및 정량화를 허용합니다. 이 실험 절차에서, 우리는 E.Coli의 대상 벡터에서 사이트 별 재조합 기술과 충분한 발현을 사용하여 태그가 없는 인간 TET2 dioxynase 촉매 도메인의 복제를 설명합니다.
우리는 한 단계에서 90 % 이상의 순도를 산출하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 활용하여 태그되지 않은 TET2 효소를 효율적으로 정제했습니다. 또한, 4개의 정상 DNA 염기와 4개의 수정된 사이토신 기지를 분리하기 위한 새로운 액체 크로마토그래피 방법을 개발했습니다. TET2 촉매 반응에서 8개의 뉴클레오시드를 정량화하기 위해, 우리는 우리의 향상된 액체 크로마토그래피 방법과 탠덤 질량 분석법을 결합했습니다.
민감한 LC-MS/MS 분석이 재조합적 태그가 없는 인간 TET2 효소의 활성을 결정하기 위해 활용되었다. 여기에 설명 된 접근 방식은 야생 유형 및 돌연변이 TET2 디산소제의 평가를 크게 향상시킬 것입니다.
