Hay más de 100 modificaciones distintas del ARN, dos tercios de las cuales son metilaciones. Este protocolo proporciona un método para el análisis sensible y preciso de la actividad del escritor de metilación de ARN. Esta técnica fácil de usar nos permite cuantificar y visualizar el ARN metilado sin el uso de anticuerpos, que son comúnmente propensos a artefactos.
Demostrando el procedimiento estará Samantha Shelton, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, configure el ensayo de ARN metiltransferasa de 100 microlitsión en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo, como se describe en el protocolo de texto. Vórtice el tubo para mezclar a fondo, y centrifugar a 200 veces g durante cinco segundos para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, limpie la reacción mediante la purificación de columnas, como se describe en el protocolo de texto. Para realizar el recuento de centelleo líquido, configure el estante de recuento de centelleo con un vial por muestra, un vial para una medición de fondo y un vial para la prueba de deslizamiento.
Llene los viales con cinco mililitros de solución de conteo de centelleo. Agregue 10 microlitros de cada muestra de ARN radiactivo eluido en un vial. Apriete la tapa y mezcle suavemente.
Para preparar los viales de prueba de deslizamiento, frote bien los hisopos de algodón en todas las superficies y equipos utilizados durante el procedimiento. Agregue estos hisopos a los viales llenos de solución de centelleo y apriete la tapa. Para ejecutar las muestras en el contador de centelleo, abra la campana del contador, inserte el bastidor en la máquina y cierre la campana.
Seleccione Count Single Rack (Recuento de rack único). Elija Seleccionar programa de usuario. Seleccione o cree un programa que mida el tritio durante 60 segundos y pulse Recuento de rack.
Repita el recuento de centelleo tres veces. Después de esto, preparar y volver a ejecutar un gel de poliacrilamida desnatural de urea, como se describe en el protocolo de texto. Transfiera 20 microlitros de material de ARN radiactivo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de 2X tampón de carga de gel.
Después de preparar la escalera, incubar las muestras a 70 grados centígrados durante 15 minutos. Lave los recipientes del gel una vez más inmediatamente antes de la carga de la muestra por tampón de pipeteo de los tanques de gel hacia abajo en los pozos del gel. A continuación, cargue 20 microlitros de la escalera preparada, 20 microlitros de las muestras y 20 microlitros de 1X tampón de carga en gel en los carriles del gel.
Ejecute el gel a 100 voltios durante 60 a 180 minutos, dependiendo del porcentaje de poliacrilamida. Una vez que el gel haya terminado de funcionar, retire el gel del cassette y colóquelo en una caja que contenga 50 mililitros de tampón 1X TBE con cinco microlitros de mancha de gel de ácido nucleico ultrasensible. Incubar en un balancín durante cinco minutos para manchar el ARN.
Después de esto, saque cuidadosamente el gel de la caja y colóquelo en el transilluminador UV del sistema de imágenes de gel con los pozos hacia arriba y la escalera a la izquierda. Enfoque la cámara en el gel, encienda la luz UV y tome una imagen del gel. A continuación, desactive la exposición UV y guarde la imagen como un archivo TIFF.
Vuelva a colocar el gel en la caja, retire el TBE y fije el gel con 50 mililitros de solución de fijación en un balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, mueva suavemente el gel a una caja negra fresca que contenga 25 mililitros de la solución que mejora la autoradiografía. Incubar el balancín a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Levante suavemente el gel y colóquelo boca abajo en una hoja de plástico con los pozos hacia arriba y la escalera en el lado derecho. Coloque dos hojas de papel cromatográfico en la parte posterior del gel y voltee toda la pila. Precaliente el secador de gel a 80 grados centígrados.
Mueva la cubierta de plástico en la secadora de gel hacia atrás. Inserte toda la pila debajo de la cubierta de plástico y mueva la cubierta de plástico hacia abajo para crear un sello. Seque el gel a 80 grados centígrados durante una hora.
A continuación, apague la secadora de gel y retire suavemente la pila. Retire la envoltura y el segundo papel de cromatografía. Pegue el papel de cromatografía restante con el gel seco en un casete de autoradiograma.
En una habitación oscura, agregue una hoja de película de autoradiografía. Almacene el cassette a 80 grados Celsius negativos y desarrolle la película en el momento adecuado, dependiendo de la intensidad de la señal. Una vez desarrollada la película, colóquela encima del cassette y utilice un marcador de laboratorio para marcar cuidadosamente los cuatro bordes del gel, cada uno y la posición de los tintes XC y BB.
Escanee la película a una resolución de 300 o 600 píxeles por pulgada y guarde la imagen como un archivo TIFF. En este estudio, se demuestra un ensayo libre de anticuerpos para analizar la actividad del ARN metiltransferasa. Una carrera típica de una reacción de transcripción in vitro con el ARN polimerasa T7 del ARN nuclear pequeño 7SK muestra ARN relativamente corto y altamente estructurado.
Hay varias bandas no deseadas, tanto cortas como más largas que 7SK, probablemente resultantes de eventos aleatorios de iniciación o terminación de transcripción. Debido a esto, la purificación de gel después de la reacción de transcripción in vitro es importante para obtener una muestra de ARN limpia. En este punto, el ARN de interés puede ser identificado por su ubicación en relación con la escalera y purificado por purificación de gel.
Aquí se muestra un ensayo representativo de ARN metiltransferasa utilizando el límite inferior de las concentraciones recomendadas de ARN y proteínas. Este ensayo permite tanto resultados cuantitativos de los recuentos de centelleo, como resultados cualitativos de la autoradiograma. Aquí, una METHYLtransferasa de ARN conocida por metilato 7SK se muestra para ser capaz de también metilato U6. Además, como se ha demostrado recientemente para 7SK, la unión de la histona H4 a MePCE también inhibe la metilación U6.
Esto se puede observar tanto en el recuento de centelleo como en el autoradiograma, mostrando la robustez de este protocolo. El ARN es susceptible a la degradación, así que asegúrese de utilizar reactivos libres de RNase y de limpiar a fondo todas las superficies y equipos. El ARN etiquetado radioactivamente obtenido de este ensayo de metiltransferasa se puede utilizar directamente para evaluar la actividad de la demetilasa de ARN o la actividad de unión al ARN mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética, por ejemplo.
Este método permite a los investigadores probar el efecto de diferentes factores en la actividad de la RNA metiltransferasa, incluyendo mutaciones puntuales y tratamientos de inhibidores de moléculas pequeñas. Este método utiliza material radiactivo, así que asegúrese de usar el EPP adecuado, y tenga cuidado durante la manipulación y eliminación de materiales radiactivos.
