Este método es muy avanzado. Tiene las divisiones del campo de la biotecnología como la ingeniería de tejidos, la terapia generativa gratuita y el cribado de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que los agregados de tamaño uniforme se pueden producir en un cultivo simple de suspensión.
Esta placa representa la posibilidad de los nuevos vasos en forma de O para la producción de agregados uniformes de células de mamíferos en el cultivo de suspensión de temblor orbital. En el cultivo de agitación orbital con los vasos convencionales, el flujo circular se produce debido a la fuerza centrífuga de la superficie media, y este flujo medio transfiere las células hacia el fondo central de los vasos. Este efecto es bien conocido como paradoja de la hoja de té Einsteins.
Este efecto provoca la acumulación excesiva de células en la parte inferior central de las células y la agregación inhomogénea. Por otro lado, los vasos en forma de O eliminan la región central, lo que impide el flujo medio de células de barrido en la región del centro-inferior. Esto limita la acumulación de celdas que pueden realizar una agregación homogénea.
Comience con un matraz de 25 centímetros cuadrados de células HEK-293 para cada recipiente que se va a sentar. Disociar las células usando 0.25%Trypsin-EDTA solución y recoger las células a través de centrifugación. Resuspender el pellet resultante en un mililitro de medio de cultivo.
Filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de 40 micras para recoger una suspensión de una sola célula. Agregue El azul de Trypan a una alícuota de la suspensión de la celda y realice un recuento de celdas. Luego prepare 20 mililitros de suspensión celular en 2 por 10 a las 5a células por mililitro.
Conecte la entrada de la bolsa en forma de O a una jeringa de 50 mililitros sujeta y, a continuación, desconecte el émbolo. Baje la suspensión celular preparada en la bolsa en forma de O a través de la jeringa sujeta. Sustituya la primera jeringa de la abrazadera por una jeringa limpia.
Agregue 55 mililitros de aire a través de la jeringa limpia para expandir la bolsa por completo. Agite el tubo de entrada y luego cierre la entrada. Por último, retire la abrazadera del tubo.
Incubar las células en la bolsa en forma de O con agitación a 45 rpm en condiciones de 35 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Para cambiar el medio en las células, primero transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros, a través de la entrada. A continuación, centrifugar durante dos minutos a 200G a temperatura ambiente.
Después de aspirar el sobrenadante, añadir 20 mililitros de medio de cultivo y resuspend las células. Agregue las células resuspendidas a la bolsa en forma de O como antes y devuelva la bolsa sellada a la incubadora de agitación. Para recoger las células, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros a través de la entrada, como antes.
Lave el interior de la bolsa con 20 mililitros de solución salina de calcio, sin fosfato de magnesio y luego drene el contenido en un tubo para recoger las células restantes de la bolsa. Centrifugar la suspensión de la célula recogida durante tres minutos a 200 veces G a temperatura ambiente y luego aspirar el supernnato. Añadir 10 mililitros de calcio, PBS libre de magnesio y ver los agregados.
Después de centrifugar como antes, retire el supernate y deje el pellet que contiene los agregados. Si se requiere un recuento celular, agregue cuatro mililitros de PBS y un mililitro de trippsina a los agregados e incubar durante 10 minutos a 37 grados Celsius para disociar las células para el conteo. Las mediciones experimentales muestran que los agregados cultivados en el plato convencional, tenían diámetros variados después de cinco días en temblor orbital.
Por el contrario, los agregados cultivados en platos o bolsas en forma de O durante cinco días, tenían diámetros mucho más uniformes. De acuerdo con la medición del tamaño basado en imágenes, el cultivo de platos convencional mostró dos picos diferentes, lo que indica una amplia desviación del tamaño agregado. Por otro lado, los agregados en platos en forma de O y bolsas en forma de O mostraron un solo pico y menos desviación de diámetro que los del plato convencional, lo que sugiere que tales agregados pueden ser de calidad más uniforme.
La hematoxilina y la tinción de eosina de secciones transversales agregadas, mostraron que los agregados cultivados en el plato convencional tenían algunas células desnucleadas y curso necrótico;sin embargo, los agregados cultivados en recipientes en forma de O no mostraban ningún curso necrótico y los agregados cultivados en la bolsa en forma de O eran tan grandes como los del plato convencional. Los recuentos celulares mostraron que más del 85% de las células sobrevivieron durante cinco días de cultivo de suspensión en cada recipiente. Este video muestra cómo manejar nuevos recipientes en forma de O para la producción de agregados de sitio uniformes de células de mamíferos en un cultivo de suspensión simple.
