この方法は非常に高度です。組織工学、自由生成療法、薬物スクリーニングなどのバイオテクノロジー分野の部門を有する。この技術の主な利点は、均一なサイズの凝集体が単純な懸濁液培養で製造できることである。
この基板は、軌道揺動懸濁液培養中の哺乳類細胞の均一な凝集体を産生するための新規O字型血管の可能性を表す。従来の血管を用いた軌道振動培養では、媒体表面の遠心力のために循環流が起こり、この媒体流は細胞を血管の中央下方に移動させる。この効果は、アインシュタイン茶葉パラドックスとしてよく知られています。
この効果は、細胞の中底および不均一な凝集における細胞の過剰な蓄積を引き起こす。一方、O字型血管は、中央底領域への中流が細胞を掃引するのを防ぐ中心領域を排除する。これにより、均質な凝集を実現できる細胞の蓄積が制限されます。
着席する各容器のためのHEK-293細胞の25平方センチメートルのフラスコから始めます。0.25%トリプシン-EDTA溶液を使用して細胞を解化し、遠心分離を介して細胞を収集する。得られたペレットを1ミリリットルの培養培地で再懸濁する。
40ミクロンの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、単細胞懸濁液を採取する。細胞懸濁液のアリコートにトリパンブルーを加え、セルカウントを実行します。その後、20ミリリットルの細胞懸濁液を10倍10倍から5番目の細胞に調製します。
O字型バッグの入口をクランプされた50ミリリットルのシリンジに接続し、プランジャーを取り外します。準備したセルサスペンションをクランプされたシリンジを通してO字型の袋に下げます。最初のクランプシリンジを清潔なシリンジに交換します。
55ミリリットルの空気をきれいな注射器で加え、袋を完全に膨張します。入口チューブをフラップし、入口を閉じます。最後に、チューブからクランプを取り外します。
摂氏35度と炭酸ガス5%の条件で45rpmで振るO字型袋に細胞をインキュベートします。細胞内の培地を変更するには、まず、細胞懸濁液を入口を介して50ミリリットルのチューブに移す。その後、室温で200Gで2分間遠心分離機。
上清を吸引した後、20ミリリットルの培地を加え、細胞を再懸濁する。以前のように再懸濁した細胞をO字型袋に加え、密閉された袋を振るインキュベーターに戻します。細胞を収集するには、細胞懸濁液を入口を通して50ミリリットルのチューブに移します。
袋の中を20ミリリットルのカルシウムで洗い、マグネシウムフリーのリン酸緩衝生理食塩水を使用し、内容物をチューブに排出して残りの細胞を袋から採取します。収集した細胞懸濁液を室温で200倍Gで3分間遠心し、次いでスーパーナテンを吸引する。カルシウムの10ミリリットルを追加, マグネシウムフリーPBSと凝集体を見ます.
前のように遠心分離した後、スーパーネイトを取り出し、骨材を含むペレットを残します。細胞数が必要な場合は、4ミリリットルのPBSとトリプシン1ミリリットルを凝集体に加え、摂氏37度で10分間インキュベートして細胞を解約します。実験測定は、従来の皿で成長した凝集体が、軌道揺れの5日後に可変直径を有していたことを示す。
対照的に、5日間O字型の皿や袋で栽培された凝集体は、はるかに均一な直径を持っていました。画像ベースのサイズ測定によれば、従来の皿培養は2つの異なるピークを示し、集合体サイズの広い偏差を示す。一方、O字型の皿およびO字型の袋の凝集体は、従来の皿の中のものよりも単一のピークと直径の偏差が少ないことを示し、そのような凝集物はより均一な品質のものである可能性を示唆した。
ヘマトキシリンおよびアゴシン染色の骨表断面は、従来の皿で成長した凝集体がいくつかの欠核細胞および壊死的な経過を有することを示したが、O字型血管で成長した凝集物は壊死的な経過を示さなかったし、O字型袋で成長した凝集物は従来の皿のものと同じくらい大きかった。細胞数は、各血管における懸濁液培養の5日間で生存した細胞の85%以上を示した。このビデオでは、単純な懸濁液培養で哺乳類細胞の均一な部位集合体を産生するための新規O字型血管を処理する方法を示す。
