Este método é muito avançado. Possui as divisões da área de biotecnologia, como engenharia de tecidos, terapia generativa livre e triagem de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que agregados de tamanho uniforme podem ser produzidos em cultura simples e suspensa.
Esta placa representa a possibilidade dos novos vasos em forma de O para a produção de agregados uniformes de células mamíferas na cultura de suspensão de agitação orbital. Na cultura de agitação orbital com vasos convencionais, o fluxo circular ocorre devido à força centrífuga da superfície média, e esse fluxo médio transfere células para o centro-fundo dos vasos. Este efeito é bem conhecido como paradoxo da folha de chá de Einsteins.
Esse efeito causa o acúmulo excessivo de células no centro-fundo das células e a agregação inhomogênea. Por outro lado, os vasos em forma de O eliminam a região central, o que impede que as células de varredura de fluxo médio entrem na região central. Isso limita o acúmulo de células que podem realizar agregação homogênea.
Comece com um frasco de 25 centímetros quadrados de células HEK-293 para cada nave estar sentada. Dissociar as células usando solução 0,25% Trypsin-EDTA e coletar células através de centrifugação. Resuspend a pelota resultante em um mililitro de meio de cultura.
Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de 40 mícrons para coletar uma suspensão de célula única. Adicione o azul Trypan a uma alíquota da suspensão celular e realize uma contagem de células. Em seguida, prepare 20 mililitros de suspensão celular em 2 vezes 10 a 5ª células por mililitro.
Conecte a entrada do saco em forma de O a uma seringa fixa de 50 mililitros e, em seguida, desprende o êmbolo. Abaixe a suspensão da célula preparada no saco em forma de O através da seringa presa. Substitua a primeira seringa de grampo por uma seringa limpa.
Adicione 55 mililitros de ar através da seringa limpa para expandir completamente o saco. Retalhe o tubo de entrada e feche a entrada. Por fim, retire o grampo do tubo.
Incubar as células no saco em forma de O com agitação a 45 rpm em condições de 35 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para mudar o meio nas células, primeiro transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros, através da entrada. Em seguida, centrífuga por dois minutos a 200G à temperatura ambiente.
Depois de aspirar o supernasce, adicione 20 mililitros de cultura média e resuspense as células. Adicione as células resuspended ao saco em forma de O como antes e devolva o saco selado à incubadora de agitação. Para coletar as células, transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros através da entrada, como antes.
Lave o interior do saco com 20 mililitros de cálcio, salina tamponada com fosfato livre de magnésio e, em seguida, drene o conteúdo em um tubo para coletar as células restantes do saco. Centrifugar a suspensão celular coletada por três minutos a 200 vezes G à temperatura ambiente e, em seguida, aspirar o supernato. Adicione 10 mililitros de cálcio, PBS livre de magnésio e observe os agregados.
Depois de centrifugar como antes, remova o supernato e deixe a pelota contendo os agregados. Se for necessária uma contagem celular, adicione quatro mililitros de PBS e um mililitro de Trypsin aos agregados e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius para dissociar as células para contar. Medições experimentais mostram que os agregados cultivados no prato convencional, tinham diâmetros variados após cinco dias em agitação orbital.
Em contraste, os agregados cultivados em pratos ou sacos em forma de O por cinco dias, tinham diâmetros muito mais uniformes. De acordo com a medição de tamanho baseada em imagem, a cultura convencional de pratos mostrou dois picos diferentes, indicando um amplo desvio de tamanho agregado. Por outro lado, agregados em pratos em forma de O e sacos em forma de O mostraram um único pico e menos desvio de diâmetro do que os do prato convencional, sugerindo que tais agregados podem ser de qualidade mais uniforme.
A hematoxilina e a mancha de eosina de seções transversais agregadas, mostraram que os agregados cultivados no prato convencional tinham algumas células desnucleadas e curso necrosado;no entanto, os agregados cultivados em vasos em forma de O não mostravam nenhum curso necrosado e os agregados cultivados no saco em forma de O eram tão grandes quanto os do prato convencional. A contagem de células mostrou que mais de 85% das células sobreviveram por cinco dias de cultura de suspensão em cada vaso. Este vídeo demonstra como lidar com novos vasos em forma de O para a produção de agregados uniformes de células de mamíferos em cultura de suspensão simples.
