Diese Methode ist sehr weit fortgeschritten. Es hat die Bereiche des Biobiotikums wie Tissue Engineering, freie generative Therapie und Arzneimittelscreening. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass gleichmäßige Größenaggregate in einfacher Federungskultur hergestellt werden können.
Diese Tafel stellt die Möglichkeit der neuartigen O-förmigen Gefäße zur Herstellung einheitlicher Aggregate von Säugetierzellen in der Orbital-Schüttelungssuspensionskultur dar. In der orbitalen Schüttelkultur mit konventionellen Gefäßen tritt der kreisförmige Fluss aufgrund der Fliehkraft der mittleren Oberfläche auf, und dieser mittlere Fluss überträgt Zellen in Richtung Mittelboden der Gefäße. Dieser Effekt ist bekannt als Einsteins Teeblatt Paradoxon.
Dieser Effekt verursacht eine übermäßige Ansammlung von Zellen in der Mitte-Unterseite der Zellen und die inhomogene Aggregation. Auf der anderen Seite eliminieren O-förmige Gefäße den Mittelbereich, der verhindert, dass mittlere Strömungszellen in den Mittel-Boden-Bereich fließen. Dies begrenzt die Anhäufung von Zellen, die eine homogene Aggregation realisieren können.
Beginnen Sie mit einem 25-Quadrat-Zentimeter-Kolben HEK-293-Zellen für jedes zu sitzende Gefäß. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0.25%Trypsin-EDTA-Lösung und sammeln Sie Zellen über Zentrifugation. Setzen Sie das resultierende Pellet in einem Milliliter Kulturmedium aus.
Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um eine einzellige Suspension zu sammeln. Fügen Sie Trypan blue zu einem Aliquot der Zellsuspension hinzu und führen Sie eine Zellanzahl aus. Dann bereiten Sie 20 Milliliter Zellsuspension bei 2 mal 10 bis zur 5. Zelle pro Milliliter.
Schließen Sie den Einlass des O-förmigen Beutels an eine geklemmte 50-Milliliter-Spritze an und lösen Sie dann den Kolben. Senken Sie die vorbereitete Zellsuspension durch die geklemmte Spritze in den O-förmigen Beutel. Ersetzen Sie die erste Klemme durch eine saubere Spritze.
Fügen Sie 55 Milliliter Luft durch die saubere Spritze, um den Beutel vollständig zu erweitern. Klappen Sie das Einlassrohr und schließen Sie dann den Einlass. Entfernen Sie schließlich die Klemme aus dem Rohr.
Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche mit Schütteln bei 45 U/min bei Bedingungen von 35 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um das Medium in den Zellen zu ändern, übertragen Sie zuerst die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr, über den Einlass. Dann Zentrifuge für zwei Minuten bei 200G bei Raumtemperatur.
Nach dem Angieren des Überstandes 20 Milliliter Kulturmedium hinzufügen und die Zellen wieder aussetzen. Fügen Sie die resuspendierten Zellen wie zuvor in den O-förmigen Beutel und geben Sie den versiegelten Beutel an den Schüttelinkubator zurück. Um die Zellen zu sammeln, übertragen Sie die Zellsuspension wie zuvor durch den Einlass in eine 50-Milliliter-Röhre.
Waschen Sie das Innere des Beutels mit 20 Milliliter Calcium, Magnesium-freie Phosphat-gepufferte Saline und dann den Inhalt in ein Rohr abtropfen lassen, um die restlichen Zellen aus dem Beutel zu sammeln. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension für drei Minuten bei 200 mal G bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann das Supernate. Fügen Sie 10 Milliliter Kalzium, Magnesium freie PBS und beobachten Sie die Aggregate.
Nach dem Zentrifugieren wie zuvor, entfernen Sie das Supernate und lassen Sie das Pellet enthalten die Aggregate. Wenn eine Zellanzahl erforderlich ist, fügen Sie vier Milliliter PBS und einen Milliliter Trypsin zu den Aggregaten hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen für die Zählung zu trennen. Experimentelle Messungen zeigen, dass Aggregate, die in der konventionellen Schale angebaut werden, nach fünf Tagen im Orbitalschütteln unterschiedliche Durchmesser hatten.
Im Gegensatz dazu hatten Aggregate, die fünf Tage lang in O-förmigen Geschirren oder Beuteln angebaut wurden, wesentlich gleichmäßigere Durchmesser. Nach der bildbasierten Größenmessung zeigte die konventionelle Schalenkultur zwei verschiedene Spitzen, was auf eine große Abweichung der Aggregatgröße hindeutet. Auf der anderen Seite zeigten Aggregate in O-förmigen Geschirren und O-förmigen Beuteln eine einzige Spitze und eine geringere Durchmesserabweichung als in der herkömmlichen Schale, was darauf hindeutet, dass solche Aggregate von gleichmäßigerer Qualität sein können.
Haematoxylin und Eosin-Färbung von Aggregatquerschnitten zeigten, dass die in der konventionellen Schale angebauten Aggregate einige denucleatierte Zellen und einen nekrotischen Verlauf enthielten; jedoch zeigten Aggregate, die in O-förmigen Gefäßen angebaut wurden, keinen nekrotischen Verlauf und die im O-förmigen Beutel angebauten Aggregate waren so groß wie die in der herkömmlichen Schale. Die Zellzählungen zeigten, dass mehr als 85% der Zellen fünf Tage Suspensionskultur in jedem Gefäß überlebten. Dieses Video zeigt, wie man neuartige O-förmige Gefäße zur Herstellung einheitlicher Standortaggregate von Säugetierzellen in einfacher Suspensionskultur handhabt.
