שיטה זו מתקדמת מאוד. יש לו את החלוקות של תחום הביוטכנולוגיה כגון הנדסת רקמות, טיפול גרני חינם הקרנת סמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי אגרגטים בגודל אחיד יכול להיות מיוצר פשוט, תרבות השעיה.
לוח זה מייצג את האפשרות של כלי בצורת O הרומן לייצור אגרגטים אחידים של תאי יונקים בתרבות המתלים המטלטלת מסלולית. בתרבות הרעידות מסלולית עם כלי שיט קונבנציונליים, הזרימה המעגלית מתרחשת בגלל הכוח הצנטריפוגלי של פני השטח הבינוניים, וזרימה בינונית זו מעבירה תאים לכיוון מרכז-תחתית כלי הדם. אפקט זה ידוע בשם פרדוקס עלי התה של איינשטיין.
אפקט זה גורם הצטברות עודפת של תאים במרכז התחתון של התאים ואת הצבירה inhomogeneous. מצד שני, כלי שיט בצורת O מחסלים את אזור המרכז המונע זרימה בינונית של תאים סוחפים לאזור המרכז-תחתון. זה מגביל את הצטברות התאים שיכולים לממש צבירה הומוגנית.
התחל עם בקבוק 25 ס"מ מרובע של תאי HEK-293 עבור כל כלי לשבת. נתק את התאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA של 0.25%Trypsin-EDTA ואאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה. תן מחדש את גלולת וכתוצאה מכך במיליליטר אחד של מדיום תרבות.
סנן את השעיית התא באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרון כדי לאסוף השעיה של תא יחיד. הוסף את טריפאן כחול לאליקוט של ההשעיה של התא ובצע ספירת תאים. ואז להכין 20 מיליליטר של השעיית תא ב 2 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר.
חבר את הכניסה של השקית בצורת O למזרק מהודק 50 מיליליטר ולאחר מכן לנתק את הבוכנה. מנמיכים את מתלי התא המוכנים לשקית בצורת O דרך המזרק המהודק. החלף את מזרק המזרק הראשון במזרק נקי.
מוסיפים 55 מיליליטר של אוויר דרך המזרק הנקי כדי להרחיב את התיק לחלוטין. תנפנפי את צינור ההנפה ואז תסגור את היכנסות. לבסוף, להסיר את המהדק מהצינור.
הדגירה את התאים בשקית בצורת O עם רעידות ב 45 סל"ד בתנאים של 35 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי לשנות את המדיום בתאים, העבר תחילה את מתלי התא לצינור של 50 מיליליטר, דרך המפרצון. ואז צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 200G בטמפרטורת החדר.
לאחר שאפו את העל-טבעי, הוסיפו 20 מיליליטר של מדיום תרבותי והשקיעו מחדש את התאים. מוסיפים את התאים המתווסכלים לשקית בצורת O כבעבר ומחזירים את השקית האטומה לאנקובטור הרועד. כדי לאסוף את התאים, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 50 מיליליטר דרך התוך, כמו קודם.
לשטוף את החלק הפנימי של השקית עם 20 מיליליטר של סידן, מגנזיום חינם פוספט מאגר מלוחים ולאחר מכן לנקז את התוכן לתוך צינור כדי לאסוף את התאים הנותרים מהשקית. צנטריפוגה ההשעיה התא שנאסף במשך שלוש דקות ב 200 פעמים G בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשאוף את supernate. מוסיפים 10 מיליליטר של סידן, PBS ללא מגנזיום וצופים באגטים.
לאחר צנטריפוגה כמו קודם, להסיר את supernate ולהשאיר את גלולה המכילה את הצבירה. אם נדרשת ספירת תאים, הוסף ארבעה מיליליטר של PBS ומיליליטר אחד של טריפסין לאגרגטים ודגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את התאים לספירה. מדידות ניסיוניות מראות כי אגרגטים שגדלו בצלחת הקונבנציונלית, היו בקטרים מגוונים לאחר חמישה ימים של רעידות מסלוליות.
לעומת זאת, אגרגטים שגדלו במנות או בשקיות בצורת O במשך חמישה ימים, היו בקוטר הרבה יותר אחיד. על פי מדידת הגודל המבוססת על תמונה, תרבות הכלים הקונבנציונלית הראתה שתי פסגות שונות, מה שמצביע על סטייה רחבה של גודל המצטבר. מצד שני, אגרגטים במנות בצורת O ושקיות בצורת O הראו שיא אחד ופחות סטייה בקוטר מאשר אלה במנה הקונבנציונלית, מה שמרמז כי אגרגטים כאלה עשויים להיות באיכות אחידה יותר.
Haematoxylin וכתמי אאוסין של חתך צבירה, הראו כי אגרגטים שגדלו בצלחת הקונבנציונלית היו כמה תאים מנוקלים כמובן נמק; עם זאת אגרגטים גדל בכלי בצורת O לא הראו שום כמובן נמק אגרגטים גדל בשקית בצורת O היו גדולים כמו אלה בצלחת קונבנציונאלי. ספירת תאים הראתה שיותר מ-85% מהתאים שרדו במשך חמישה ימים של תרבות השעיה בכל כלי. סרטון זה מדגים כיצד להתמודד עם כלי שיט חדשניים בצורת O לייצור אגרגטים אחידים של תאי יונקים בתרבות השעיה פשוטה.
