이 방법은 매우 고급입니다. 조직 공학, 무료 생성 요법 및 약물 스크리닝과 같은 생명 공학 분야의 부서를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 균일 한 크기 응집체가 간단하고 서스펜션 문화에서 생성 될 수 있다는 것입니다.
이 보드는 궤도 흔들림 현탁액 배양에서 포유류 세포의 균일 한 응집체의 생산을위한 새로운 O 자형 선박의 가능성을 나타냅니다. 종래의 선박을 가진 궤도 흔들림 배양에서, 원형 유량은 중간 표면의 원심력 때문에 발생하며, 이러한 중간 유량은 혈관의 중심 바닥으로 세포를 전달한다. 이 효과 아인슈타인 티 잎 역설로 잘 알려져 있다.
이 효과는 세포의 중앙 바닥에 있는 세포의 과잉 축적 및 불동성 집계를 일으키는 원인이 됩니다. 한편, O자형 용기는 중간유류를 방지하는 중심 영역을 제거하여 중간-바닥 영역으로 세포를 스위핑한다. 이것은 균질성 응집을 실현할 수 있는 세포의 축적을 제한합니다.
각 용기가 앉을 수 있도록 HEK-293 셀의 25 평방 센티미터 플라스크로 시작합니다. 0.25%의 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 분리하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 배양 배지의 1 밀리리터에서 결과 펠릿을 다시 중단합니다.
40 미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 필터링하여 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액의 알리쿼트에 Trypan blue를 추가하고 셀 수를 수행합니다. 그런 다음 밀리리터 당 5 세포에 2 회 10 회 10 에서 세포 현탁액의 20 밀리리터를 준비합니다.
O자형 가방의 입구를 50밀리리터 주사기에 연결한 다음 플런저를 분리합니다. 준비된 셀 서스펜션을 고정 주사기를 통해 O자형 가방에 넣습니다. 첫 번째 클램프 주사기를 깨끗한 주사기로 교체합니다.
깨끗한 주사기를 통해 55밀리리터의 공기를 추가하여 가방을 완전히 확장합니다. 입구 튜브를 플랩한 다음 입구를 닫습니다. 마지막으로 튜브에서 클램프를 제거합니다.
섭씨 35도, 이산화탄소 5%의 조건에서 45rpm에서 흔들리는 O자형 가방에 세포를 배양합니다. 세포내의 배지를 변경하려면 먼저 셀 현탁액을 입구를 통해 50 밀리리터 튜브로 옮는다. 그런 다음 실온에서 200G에서 2 분 동안 원심 분리기.
상체를 달아난 후, 배양 배지의 20 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단합니다. 다시 매달린 셀을 이전과 같이 O 자형 가방에 넣고 밀봉된 가방을 흔들어 있는 인큐베이터에 반품합니다. 세포를 수집하려면 세포 현탁액을 이전과 마찬가지로 유입구를 통해 50 밀리리터 튜브로 옮킨다.
20 밀리리터의 칼슘, 마그네슘 프리 인산염 완충식식염으로 가방 내부를 씻은 다음 내용물을 튜브로 배출하여 가방에서 남은 세포를 수집합니다. 수집된 셀 서스펜션을 실온에서 200배 G로 3분간 원심분리한 다음 슈퍼네이트를 흡입합니다. 칼슘 10밀리리터, 마그네슘 프리 PBS를 추가하고 골재를 시청하세요.
원심 분리 후, 슈퍼네이트를 제거하고 골재를 포함하는 펠릿을 둡니다. 세포 수가 필요한 경우, PBS의 4 밀리리터와 트립신1밀리리터를 골재에 넣고 37도에서 10분 동안 배양하여 셀을 분리하여 계산에 대한 세포를 해리시합니다. 실험적인 측정에 따르면 종래의 접시에서 자란 골재는 궤도 흔들림에서 5일 후에 직경이 다양했다는 것을 보여줍니다.
대조적으로, O 자형 요리 나 가방에서 5 일 동안 재배 된 집계는 훨씬 더 균일 한 직경을 가지고 있었다. 이미지 기반 크기 측정에 따르면, 종래의 접시 배양은 두 개의 상이한 피크를 보였으며, 이는 골재 크기의 폭 넓은 편차를 나타낸다. 한편, O자형 요리와 O자형 가방의 골재는 기존 요리에 비해 직경이 한 개 나 낮아 지름이 적어 균일한 품질이 더 균일할 수 있음을 시사합니다.
헤마톡시린과 에신 염색골은 종래의 접시에서 자란 골재가 일부 탈핵세포와 괴사 과정을 가지고 있음을 보여주었지만, O자형 용기에서 자란 골재는 괴사 코스와 O자형 가방에서 재배된 골재가 기존 요리에 비해 크지 않았다. 세포 수는 세포의 85% 이상이 각 용기에서 5일간의 현탁액 배양동안 살아남았다는 것을 보여주었습니다. 이 비디오는 간단한 현탁액 배양에서 포유류 세포의 균일 한 사이트 집계의 생산을위한 새로운 O 자형 혈관을 처리하는 방법을 보여줍니다.
