El endometrio es un tejido que cambia cada mes en respuesta a las hormonas. El desequilibrio hormonal puede prevenir la unión de embriones y también causar enfermedades como el cáncer. Nuestro protocolo reconstruye el endometrio para que pueda ser estudiado fuera del cuerpo de la mujer de una manera fisiológica.
La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una estructura 3D de células compuestas por dos tipos de células hormonalmente sensibles, las células epiteliales y estroma que se organizan y se comportan específicamente como lo hacen en el cuerpo. Dado que los organoides pueden imitar mejor el comportamiento del tejido, eventualmente se pueden utilizar para probar diferentes fármacos. Los organoides endometriales se pueden utilizar para estudiar los efectos directos de los factores de riesgo actualmente conocidos para el cáncer, incluyendo la obesidad y el síndrome de ovario policístico.
Nuestros organoides enfatizan la importancia de las acciones paracrinas entre dos tipos de células. Es importante comenzar con una cantidad adecuada de tejido. Obtener la densidad correcta de las células epiteliales y estromales puede ser complicado.
Además, los organoides son bastante pequeños y pueden ser difíciles de visualizar con tinción IHC. La visualización de este procedimiento es importante porque hay algunos pasos que serán mucho más fáciles de entender después de verlos. Estos incluyen obtener la capa de tejido correcta del útero, conseguir la densidad correcta de las células para combinar, y la siembra de los moldes de agarosa.
Antes de comenzar el aislamiento celular, fundir y equilibrar micromoldeos de agarosa al 1,5% de acuerdo con las instrucciones del fabricante de albergar los organoides. En un gabinete de bioseguridad, utilice técnicas asépticas para preparar una solución enzimática a 37 grados Celsius y filtre la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un tubo cónico de 15 mililitros. Usando un bisturí, raspa el endometrio de las biopsias uterinas y pica el tejido en trozos muy pequeños.
Coloque el tejido recién picado en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene la solución enzimática. Cierre la tapa y envuelva la parte superior del tubo con una película de cera para evitar la contaminación. Coloque el tubo en un baño de agua o incubadora a 37 grados Centígrados durante 30 minutos con agitación suave.
Después de esto, apile un colador celular de 100 micras encima de un colador celular de 20 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Filtrar la solución a través de los dos coladores. Enjuague el tubo cónico de 15 mililitros con HBSS y coloque este lavado a través del colador para asegurarse de que todas las células se recogen.
Luego, invierta el colador celular de 20 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y lave las células epiteliales del colador con 20 mililitros de medios organoides complementados con 1%penicilina y estreptomicina. Centrifugar los tubos cónicos a 500 G durante cinco minutos. Para las células estromales recogidas, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en 10 mililitros de tampón de lylisis de glóbulos rojos.
Incubar a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Centrifugar estas células a 500 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet con 200 a 300 microlitros de medios organoides.
Para las células epiteliales recogidas, retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 100 microlitros de medios organoides. Después de que los moldes de 1,5% de agarosa estén equilibrados, retire el medio organoide en el exterior de los moldes de agarosa e incline la placa de cultivo de tejido para que el medio de la cámara de siembra celular de los platos de agarosa también se pueda eliminar cuidadosamente. Vea las suspensiones epiteliales y estromales bajo un microscopio y agregue más medios organoides a las suspensiones, asegurándose de agregar sólo 100 microlitros a la vez para que la suspensión sea aproximadamente igual en densidad.
Luego combina una parte de las células estromales con tres partes de las células epiteliales por volumen. Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular combinada en la cámara de siembra celular del molde de agarosa. Una vez que los moldes de agarosa están llenos de células, agregue cuidadosamente 400 microlitros de medios organoides frescos en los pozos de la placa de 24 pozos.
Incubar a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono, asegurándose de cambiar el medio cada segundo día con 500 microlitros de medios organoides. Después de siete días, cambiar el medio a uno que se complementa con 0.1 estradiol nanomolar y 0.8 testosterona nanomolar para promover la organización de las células epiteliales y estromales. Primero, disolver 1.5% de agarosa en PBS por ebullición.
Coloque la agarosa líquida en un vaso de agua caliente y deje que se enfríe a aproximadamente 50 grados centígrados. Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pozos y pipetee cuidadosamente el medio desde el exterior del molde de agarosa. A continuación, pipetee cuidadosamente el medio del interior del molde de agarosa para evitar interrumpir los organoides.
Añadir cuidadosamente entre 70 y 75 microlitros de calor, 1,5% agarosa en la cámara de la agarosa, teniendo cuidado de no molestar a los organoides. Deje que la placa se enfríe a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, agregue 4%paraformaldehído en cada pozo de la placa de 24 pozos y fije todo el molde de agarosa sellado durante la noche a cuatro grados Celsius.
Al día siguiente, almacene la placa en 70% etanol a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para procesar para la incrustación de parafina. Para comenzar el aislamiento de ARN, vea la placa bajo un microscopio de disección. Incline la placa y pipetee cuidadosamente el medio de la cámara del molde de agarosa.
Pipeteando con fuerza un mililitro de medio organoide fresco directamente en el molde de agarosa para que los organoides se expulsen de los micropocillos, teniendo cuidado de no crear demasiadas burbujas. Repita este proceso de pipeteo contundente una vez utilizando el mismo medio. Después de esto, recoger todo el medio que contiene los organoides.
Centrifugar a 500 G para recoger los organoides, y proceder a la extracción de ARN. En este estudio, se generan organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Para el procesamiento histológico, los moldes de agarosa que contienen los organoides endometriales se sellan con agarosa, seguidos de fijación con 4%paraformaldehído durante la noche.
Estos moldes se procesan para la incrustación de parafina estándar seccionada y teñida para histología, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. La hematoxilina en la tinción de eosina revela una estructura similar a la esferoides con una sola capa de células que recubren el exterior y las células en el centro. Los marcadores específicos de células para células endometriales, epiteliales y estromales revelan células epiteliales que rodean el organoide con células estromales en el centro.
Los marcadores de fisiología endometrial confirman que los organoides endometriales conservaron ciertas características del tejido nativo. La tinción de tri-cromo, que mancha el colágeno azul y los glóbulos rojos, muestra la presencia de colágeno dentro del centro donde residían las células estromales, demostrando la producción activa y secreción de colágeno por células estromales similares al tejido nativo. Además, la tinción inmunohistoquímica revela la presencia de receptores de estrógeno, receptores de andrógenos y receptores de progesterona en las células epiteliales y estromales.
Es importante planchar las células densamente para que tengamos suficientes organoides para experimentos posteriores. Esto requerirá un poco de práctica. Los organoides endometriales se pueden cultivar en diferentes condiciones y luego cosecharse para experimentos como inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia para estudiar la expresión de proteínas o cosechar arneses para estudiar la expresión génica.
Nuestro laboratorio investiga cómo el endometrio responde a los niveles hormonales alterados, que pueden conducir a la hiperplasia endometrial y el cáncer. Podemos utilizar estos organoides para tratamientos a largo plazo de las hormonas y agregar condiciones patológicas como el exceso de testosterona que se encuentra en el síndrome de ovario policístico, o señales de adipocitos para estudiar los cambios endometriales inducidos por la obesidad. Los tejidos humanos se consideran biopeligrosos, y será importante tomar las precauciones adecuadas.
