Agradecemos a Verónica Schreiter por su excelente asistencia técnica y modificaciones útiles del modelo de cultura de técnica y de la célula de criopreservación establecido. Además, queremos agradecer a Maren Anders y Swanhild Rodewald por su excelente asistencia técnica en el análisis posterior.

Nota: Los ovarios bovinos se obtuvieron de un matadero comercial. La colección de subproductos de matadero no requiere una aprobación ética según la ley alemana.
1. condiciones de trabajo y preparativos
<ol><li>Para garantizar la esterilidad, realizar todos los medios y preparación de tejido, así como toda cultura de trabajo en un laboratorio de cultura de célula especializada utilizando un banco de flujo laminar.</li>
	<li>Preparar 1 x de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina para el transporte de los ovarios. Nota: La duración máxima entre recibir los ovarios y aislar el GC es de 2 horas en este montaje.</li>
</ol>2. aislamiento de células de la Granulosa bovina
<ol><li>
Lave los ovarios varias veces en PBS 1 x (con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina) para quitar la sangre de la superficie antes de iniciar el procedimiento de aislamiento. Utilizar un vaso de precipitados, coloque los ovarios dentro, llenar con PBS 1 x y descartar el PBS otra vez.
	<ol>
<li>Repita este paso de lavado 3 – 4 x, hasta que los ovarios se limpian de sangre restante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie un ovario con un laboratorio para limpiar con alcohol al 70%, para reducir posibles contaminaciones.</li>
	<li>Con una jeringa de 3 mL y una aguja de 18 G, Aspire la GC por punción de los folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm, mide con una regla) y el líquido folicular en un tubo de centrífuga de 50 mL. Nota: Para humedecer la jeringa, tome una pequeña cantidad de PBS 1 x (con 100 UI penicilina estreptomicina de 0,1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina). Esto ayuda a recoger pequeñas cantidades de líquido folicular y evita que las células se pegue dentro de la jeringa.</li>
	<li>Después de pinchar varios folículos, enjuague la jeringa y aguja con 1 x PBS para la limpieza intermedia.</li>
</ol>3. criopreservación de las células
<ol><li>
Utilizar la tinción de azul de tripano y contar las células en un hemocitómetro.
	<ol>
<li>Para contar el número de células viables, preparar un tubo con 1,5 μl de una solución de 0.25% azul de trypan. Nota: Las células vivas permanecerá sin mancha porque azul trypan sólo puede acceder a la barrera de la célula de células muertas, que luego aparecen en azul.</li>
		<li>Añadir 15 μl de la suspensión de células de la granulosa a la solución de azul de tripano y mezclar suavemente.</li>
		<li>Coloque la mezcla en ambas cámaras un hemocitómetro. Contar el número de la vida (p. ej., mancha) las células en una gran plaza por cámara. Nota: Aunque se observan algunas células de la sangre, se puede distinguir por su tamaño muy pequeño.</li>
		<li>Calcular el número de células vivas con la media de ambos cuadrados de cámara según las directrices generales; la proporción de las células vivas puede variar entre los ovarios pero debe exceder 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toma una muestra de la piscina de la célula de granulosa recientemente aisladas como referencia para su posterior análisis.
	<ol>
<li>Dependiendo de la cuenta de célula de la GC aislado, reservar un número adecuado de células como muestras de referencia de RNA, DNA o proteína preparación. Nota: Para el aislamiento de RNA y la posterior evaluación de la expresión génica, las 1 x 105 células son suficientes, mientras que otros análisis posteriores podrían requerir un número de células diferentes, generalmente más alta.</li>
		<li>Coloque una o varias partes alícuotas de las células de referencia en un fresco tubo y centrifugar durante 1 minuto a temperatura ambiente y velocidad máxima (12.000 x g) para obtener un precipitado de células. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Inmediatamente choque-congelación de las muestras en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Llevar a cabo la criopreservación como sigue.
	<ol>
<li>Preparar el medio de congelación con 80% de suero de ternero fetal (FCS) y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
		<li>Para suavemente de la pelotilla de la GC, centrifugar el GC por 3 min a temperatura ambiente y x 500 g.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 100% FCS (p. ej., 1 mL) hasta no más celulares macizos son visibles.</li>
		<li>Agregar 1 volumen (por ejemplo, 1 mL) del medio de congelación preparado para la suspensión de células y transferir la mezcla a un frasco de criogénico. Nota: La concentración final de los medios de protección de cryo será 90% FCS y 10% DMSO.</li>
		<li>Coloque el frasco criogénico en un recipiente de congelación (disponible comercialmente) especializado que impide la congelación rápida. La velocidad de enfriamiento de las muestras no debe exceder-1 ° C/min transferencia el recipiente congelación en un congelador de-80 ° C durante al menos 4 h.</li>
		<li>Para un almacenaje más largo, coloque los frascos criogénicos en contenedores de ultra baja temperatura (por ejemplo, contenedores de nitrógeno líquido de fase). Nota: El protocolo se puede detener aquí, como la criopreservación permite un almacenaje más largo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparación de medios de comunicación y cultura placas para cultivo celular
<ol><li>
Capa celular placas con 0,02% de colágeno R. Nota: Colágeno R es conocido por ser esencial para una mejor sujeción de GC en cultura.<ol>
<li>Preparar una solución de R 0.02% colágeno con agua purificada apta para cultivo celular.</li>
		<li>Añadir 150 μL por pocillo de una placa de 24 pocillos (= 2 cm2/pozo) y asegurar que toda la superficie de la cultura está bien cubierta con la solución de colágeno I.</li>
		<li>Deje que la solución seque con la tapa abierta durante unas horas o toda la noche en la campana de flujo laminar.</li>
		<li>Cuando las placas estén completamente secas, les irradiar con luz ultravioleta durante 10-15 min minimizar la contaminación.</li>
		<li>Si es necesario, almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar los medios de comunicación y suplementos para el trabajo de la cultura bajo una campana de flujo laminar. Para una recuperación exitosa de la GC, tienen que ser procesados inmediatamente después de descongelarla.</li>
	<li>
Preparar los siguientes medios.
	<ol>
<li>Suplemento medio esencial mínimo de α (α-MEM) con 2 mM L-glutamina, bicarbonato de sódico 0,084%, 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM HEPES, selenito de sodio de 4 ng/mL, 5 transferrina μg/mL, 10 ng/mL insulina y 1 mM no esenciales aminoácidos.</li>
		<li>Además, agregar estreptomicina penicilina y 0.1 mg/mL 100 UI a los medios de comunicación. Nota: Los antibióticos, una vez calentados, son estables durante aproximadamente 48 horas. Por lo tanto, alícuota la cantidad deseada de los medios de comunicación para la creación de cultura y medios de comunicación previsto intercambiar. Caliente previamente sólo las alícuotas de los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua. Los medios preparados pueden conservarse a 4 ° C durante no más de 3 meses.</li>
		<li>Para inducir la actividad esteroide en GC bovino cultivada, suplemento del α-MEM además con 20 ng/mL hormona folículo-estimulante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 y 2 μm androstenediona. Nota: Siempre complementar estos componentes poco antes del inicio de un cambio de cultura o los medios de comunicación. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación para soluciones FSH y el IGF-1, ya que esto podría comprometer la actividad esteroide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. trabajo de la cultura de la célula
<ol><li>Descongelar las células rápidamente en un baño de agua a 37 ° C durante 3 – 4 minutos y transferir la suspensión de células a 37 ° C con α-MEM (sin suplemento de hormona). Para la centrifugación, se recomienda un volumen final de 10 mL.</li>
	<li>Centrifugue la GC por 3 min a temperatura ambiente y a 500 x g. Deseche el sobrenadante. Agregar a precalentado y suplido α-MEM y resuspender las células con cuidado.</li>
	<li>Semilla de la GC en una densidad de 1 x 105 o 1 x 106 células por pocillo en un volumen final de 500 μl. incluye repeticiones técnicas de al menos tres pozos de cultura por condición.</li>
	<li>Incubar el cultivo de células en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 para el 8 d.</li>
	<li>Realizar un intercambio de medios de comunicación todos los días. Reemplazar sólo las dos terceras partes de los medios de cultivo para reducir el estrés y facilitar la adaptación de las células a los medios de comunicación fresco. Nota: El GC forman un fenotipo típico de fibroblasto-como después de unos días en la cultura y tienden a agrupan. En la cultura de alta densidad celular, grupos más grandes se encuentran más frecuentemente en comparación con la cultura de densidad normal GC (figura 1, izquierda vs derecha panel).</li>
</ol>6. posterior análisis de células de la Granulosa cultivadas
<ol><li>Para realizar el análisis de la hormona esteroide, recoger los medios de comunicación y congelar a-20 ° C. Utilizar métodos apropiados para analizar la concentración de estradiol y progesterona en el pasado los medios de comunicación [por ejemplo, radioinmunoanálisis (RIA)]14.</li>
	<li>Para el posterior análisis de moléculas diferentes (RNA, DNA, proteínas, etc.), lyse las células directamente en la placa de cultivo con un agente lisis apropiado según lo recomendado por el proveedor. Nota: Para la mayoría de los procedimientos de aislamiento, es posible dejar el protocolo, como las células sometidas a lisis pueden conservarse a-20 ° C hasta 1 semana. Para un almacenaje más largo, las células deben ser mantenidas a-80 ° C.</li>
	<li>Para determinar la abundancia de transcripción, sintetizar cDNA y medir en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (qPCR) la reacción en cadena técnicas15transcripciones específicas. Una evaluación estadística debe incluir al menos tres réplicas de culturas diferentes de la célula, originadas de preparaciones de diferentes celulares (Replica biológica).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de cultura de célula presentado ofrece una herramienta para analizar granulosa célula diferenciación in vitro. Varios estudios demostraron que un cultivo libre de suero es un requisito para mantener la actividad esteroide cultivada bovina GC o GC de otras especies8,9. Además, cubriendo la placa de cultivo con componentes de la matriz extracelular (p. ej., colágeno I)13, mejoró la fijación de las células considerablemente. Otra característica importante es el período de cultivo prolongado. Recientemente, se ha demostrado que una cultura a largo plazo es necesaria para obtener suficiente actividad esteroidogénica y una expresión equilibrada de granulosa célula identidad marcadores17. Parece que la GC requiere tiempo para recuperarse del estrés físico durante el procedimiento de aislamiento.
Los suplementos de los medios de comunicación FSH, IGF-1 y la androstenediona son conocidos por inducir la actividad de la aromatasa en cultivan GC. Sobre todo, los suplementos con androstenediona es absolutamente necesario, como el GC necesita un precursor para la síntesis de estradiol. Esto ha sido publicado previamente11,18 y, por lo tanto, no fue más investigado durante el presente estudio. Sin embargo, una adaptación de la FSH, IGF-1 y las concentraciones de androstenediona puede ser necesaria para otros montajes experimentales.
La técnica de criopreservación descrita aquí puede ayudar a mejorar la organización de los experimentos de cultivo de tejidos por lo que los hace más independientes de la fuente variable con los ovarios. Según pruebas previas, la criopreservación no afecta el fenotipo de GC o la producción de esteroides en la cultura. Además, la abundancia de las transcripciones de marcador en las células cultivadas no reveló diferencias significativas comparando muestras preparadas de células recién aisladas con los previamente sometidos a criopreservación16.
Un parámetro fundamental para el modelo actual de la cultura de GC es la célula placas de densidad. Como se muestra en los Resultados de representante, aumentando la densidad de placas indujo cambios notables de las características fisiológicas y moleculares. Varios genes se regulan de manera específica, que se asemejan a los cambios que son inducidos por la estimulación de la LH en vivo4,19. El hecho de que un aumento de la densidad celular puede conducir a procesos de diferenciación como en GC bovino cultivada debe considerarse meticulosamente en este modelo de GC en vitro para evitar resultados contradictorios entre repeticiones. Por lo tanto, resultados contradictorios con otros estudios podrían atribuirse a las densidades celulares diferentes y deben ser examinadas más de cerca.
El modelo de cultura descrito aquí se reveló que no responden a la LH, como los transcritos del receptor de la LHCGR están cerca del límite de detección. Por lo tanto, una simulación de la oleada de LH por igual la situación en vivo no pudo inducir diferenciación13. Sin embargo, este modelo proporciona una herramienta útil para el estudio activo estradiol GC en cultivo primario, en particular como no funcional bovinas líneas de GC existen en la actualidad.
Diferentes protocolos de tratamiento pueden probarse en el actual modelo de cultura de la GC que ayudan a desentrañar los mecanismos de regulación de la producción de esteroides o diferenciación de GC. Factores más, solos que están involucrados en procesos de desarrollo pueden analizarse por separado. Por lo tanto, este modelo de cultura proporciona una base para muchas aplicaciones diferentes.

Luteinización y ovulación exitosa dependen de alteraciones moleculares finamente afinadas y bien orquestadas en tipos de la célula folicular somáticos diversos. Puesto que los detalles de estos procesos de desarrollo no se entienden todavía completamente, más aclaración se requiere. Métodos in vivo son elaborados y costosos y, en particular, no mecanismos moleculares específicos de la dirección que se producen durante la Foliculogénesis. Por lo tanto, modelos reduccionistas en vitro se necesitan además, para proporcionar la penetración en datos de celulares y moleculares. Diferentes estudios describen la cultura de los folículos todo en el contexto de en vitro fecundación técnicas1,2,3. Porque los investigadores están interesados en los mecanismos de diferenciación, muchos estudios se centran en GC folicular. Estas células, directamente asociadas con el ovocito, son las principales fuentes de producción de estrógeno y, por lo tanto, juegan un papel esencial en la Foliculogénesis y luteinización4.
Inmortalizado células de especies diferentes se han desarrollado líneas de GC. La mayoría de ellos, sin embargo, no muestra suficiente hormona esteroide producción5. Hasta ahora, sólo uno de células de bovino que GC ha sido establecida6, pero esta línea perdió su actividad esteroidogénica después de varios pasajes7. Por lo tanto, desde la esteroidogénesis y, en particular, producción de estradiol es un rasgo esencial de la funcionalidad de la GC, es conveniente estudiar estos aspectos en modelos de cultura de célula primaria. En estudios previos, se demostró que sólo se puede observar una producción considerable de estradiol bajo condiciones de cultivo libre de suero8,9. Además, la suplementación de un precursor de la síntesis de estradiol es otro requisito previo, GC no expresan la enzima necesaria que puede convertir progesterona androstenediona10. Además, el efecto sinérgico de la FSH y el IGF-1 suplementación en vitro revelaron una actividad optimizada de la aromatasa, la enzima dominante del estradiol síntesis11. En el presente Protocolo, también se describen otros factores importantes que tienen un impacto sustancial en el modelo de cultura de la GC. En particular, la célula galjanoplastia densidad tiene enormes efectos sobre el resultado del experimento12. Además, se pudo establecer una técnica de criopreservación de GC bovina que no interfiere significativamente con la fisiología de la GC en la cultura. Esta técnica ayuda a mejorar la organización del trabajo de la cultura de célula y a optimizar la densidad de placas preferido.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Las células granulosas del ovario (GC) son la mayor fuente de síntesis de estradiol. Inducida por el aumento preovulatorio de hormona luteinizante (LH), las células de la teca y, en particular, de la capa de células de la granulosa profundamente cambian sus características morfológicas, fisiológicas y moleculares y forman el corpus de la producción de progesterona lúteo que se encarga de mantener el embarazo. Modelos de celulares de cultura son herramientas esenciales para el estudio de los mecanismos reguladores subyacentes implicados en la transformación folliculo-lútea. El protocolo presentado se centra en el procedimiento de aislamiento y criopreservación de GC bovina de folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm). Con esta técnica, puede obtenerse una población casi pura de GC. El procedimiento de criopreservación facilita enormemente el tiempo de gestión de la cultura de célula de trabajo independiente de una fuente de tejido (ovarios) de primaria directa. Este protocolo describe un modelo de cultura de célula libre de suero que imita el estado activo estradiol de GC bovina. Condiciones importantes que son esenciales para un cultivo exitoso celular activo esteroide se discuten en el protocolo. Está demostrado que aumentar la densidad de placas de las células induce una respuesta específica como lo indica una producción de perfil y de la hormona de expresión de gen alterado. Además, este modelo proporciona una base para futuros estudios sobre diferenciación de GC y otras aplicaciones.

GC plateado 1 x 105 células/pozo pantalla un aspecto fibroblasto-como típico ya que forman una extensión celular comparable a fibroblastos y tienden a crear clústeres (Figura 1a y 1C). Aumento de la densidad de placas por 10 veces a 1 x 106 células/pocillo no cambió la morfología pero más racimos de célula pueden observarse (Figura 1b y 1D, flechas). Como ya se indica en una publicación anterior, la capa de colágeno de los platos de la cultura en gran medida mejora la fijación de las células13.
Criopreservación de inicial no cambió considerablemente las características fisiológicas de las células en cultivo en comparación con los cultivados directamente de muestras recién aisladas. Esto se muestra en la figura 2 como la abundancia de transcripción (medida por qPCR) de marcador varios genes no difirió al comparar células cultivadas derivadas de piscinas ya sea congelados o recién aislados.
La figura 3 muestra resultados representativos de los análisis de hormonas esteroideas (medido por RIA) en GC bovino cultivada en normal y alta densidad. La concentración de estradiol es disminuyó significativamente en la cultura de alta densidad en comparación con la cultura de densidad normal, mientras que la producción de progesterona tiende a ser mayor.
Un análisis comparativo de varios genes (medido por qPCR) en alta vs densidad normal culturas reveló un efecto significativo (figura 4). CYP19A1, codificación de la enzima clave de la biosíntesis de estradiol aromatasa, así como el receptor de gonadotropinas FSHR, fueron significativamente regula. En contraste, los genes RGS2 y VNN2 demostraron una significativa para arriba-regulación. Estos resultados sugieren claramente que induce procesos específicos de la diferenciación celular mediante el aumento de la célula de densidad de la galjanoplastia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figura 1: cultivo de células de la granulosa bovina en normal (paneles de la izquierda) y alta densidad celular (paneles de la derecha). (y c) las células cultivadas con una densidad de 1 x 105 células/pozo muestran un fenotipo típico de fibroblasto-como. (b y d) GC cultivada en una chapado alta densidad (1 x 106 células/pocillo) tienden a formar racimos de célula grande (flechas) con mayor frecuencia en comparación con las células bajo una densidad normal (panel izquierdo). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figura 2: comparación de células cultivadas directamente después de aislamiento y criopreservación de. Las células fueron cultivadas con una densidad de 1 x 105 células por pocillo. La expresión génica de varias transcripciones de marcador se evaluó y no reveló ninguna diferencia entre las células cultivadas con o sin una criopreservación inicial. El boxplot muestra la mediana de n = 3. De Student dos colas t-test, p-los valores están incluidos. Esta figura se reproduce de Baufeld y Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figura 3: concentración de hormonas esteroides en células de la granulosa cultivadas en placas diferentes densidades. La concentración de estradiol (E2) disminuyó significativamente cuando los GC fueron cultivadas en una alta densidad celular, mientras que la concentración de progesterona (P4) sólo tendió a ser mayor. La concentración de la hormona fue corregida para que el contenido de ADN normalizar para un número diferente de células. La media y SEM de n = 3 se muestran. p > 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. Esta figura se reproduce de Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figura 4: Abundancia de transcripciones claves funcionales en células de la granulosa cultivadas en una normal frente a una densidad de placas alta. GC bovino cultivada bajo condiciones libre de suero para el 8 d reveló una regulación específica de varios genes del marcador seleccionado. El boxplot muestra la mediana de n = 3 réplicas individuales. p < 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.

Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.1K vistas.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.

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Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Investigación

Medicina

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Biología del Desarrollo

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Bioingeniería

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Establecimiento de una monocapa 2D a partir de un cultivo 3D de enteroide ileal bovino

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Autor destacado: Modelo enteroide avanzado para estudiar las interacciones huésped-patógeno 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

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Heterotípicos tridimensional

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Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio

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Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional