Un protocolo de muestreo imparcial es vital para la microscopía electrónica. Si desea cuantificarlo sobre la densidad numérica de las sinapsis u otras estructuras en un área cerebral determinada, la principal ventaja de nuestra técnica es que es imparcial, y permite producir automáticamente micrografías electrónicas con una mínima intervención del usuario. Esta técnica también es valiosa en otras áreas de investigación, como la neurociencia, donde se puede utilizar en la evaluación de la fuerza de una red neuronal.
Para aplicar nuestro protocolo, es necesario tener experiencia en técnicas microscópicas electrónicas, como la preparación de muestras y el funcionamiento de un microscopio electrónico de transición. Stefan Wernitznig, un post-doc de mi laboratorio. Este protocolo consiste en preparar muestras cerebrales para la microscopía electrónica, cortando pares de secciones delgadas.
A continuación, describirá cómo producir automáticamente un número definido de micrografías electrónicas en un área de interés. A continuación, utilizará un marco de recuento para evaluar la densidad numérica de las entidades estructurales. Para comenzar, diseccionar, fijar, corregir e incrustar muestras de interés en la incrustación de resina siguiendo junto con el protocolo de texto adjunto.
A continuación, coloque la muestra en un ultramicrotoma y produzca secciones seriales ultradelgadas de 55 nanómetros. Coloque las secciones en una rejilla de ranura con las dimensiones de un milímetro por dos milímetros, recubiertas con forma de piola. A continuación, contrarresta las secciones ultra delgadas en las rejillas de ranura utilizando 2%acetato de uranilo durante 30 minutos, seguido de citrato de plomo durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Coloque la rejilla en el TEM y examine las secciones de la cuadrícula con el TEM utilizando un aumento bajo para orientar y evaluar la calidad de las secciones. A continuación, inicie el software TEM Serial Section, seleccione Sección y elija Insertar para agregar los puntos de esquina para la sección de referencia y búsqueda. Siga las instrucciones de la ventana emergente.
Comience con la sección de referencia y, a continuación, continúe con la sección de búsqueda. Asegúrese de que los bordes de la sección son paralelos a la siguiente sección, ya que se introducen los puntos uno y dos. A continuación, visualice la sección de referencia en baja ampliación para identificar la región de interés.
Mueva la etapa del microscopio utilizando el análisis de imágenes TEM en la sección de referencia a varios puntos de esquina del ROI para crear un esquema del ROI. Registre las coordenadas del polígono resultante utilizando el software Random Point Sampling. Para ello, presione Agregar coordenadas en el cuadro de diálogo del software Muestreo de puntos aleatorios en cada punto del polígono que sea necesario para delinear el ROI en la sección.
A continuación, defina e introduzca un tamaño adecuado para las áreas de muestreo y las distancias entre las áreas en el software de muestreo de puntos aleatorios. A continuación, presione Calcular ráster para generar coordenadas de forma sistemática, uniforme y aleatoria para las posiciones del micrográfico dentro del polígono. Almacene los puntos de muestreo en las secciones de referencia y búsqueda, utilizando el software Random Point Sampling y el software TEM Serial Section.
Estas son las coordenadas de los montajes que se registran después. En el software Random Point Sampling, pulse ir a la siguiente posición para mover la etapa del microscopio a las coordenadas x y de cada área de muestreo en la sección de referencia. A continuación, seleccione Ubicación y elija Insertar para importar estas coordenadas en el software TEM Serial Section en la sección de referencia.
Repita esto para todas las coordenadas. Para reflejar las coordenadas de la sección de referencia en la sección de búsqueda, seleccione Sección y elija Ir a sección. Introduzca el número de la sección de búsqueda en la ventana de diálogo.
Para la grabación de los montajes, cambie entre la sección de referencia y búsqueda, como se describió anteriormente, y cambie la posición en la sección de referencia con ubicación y vaya al número. Elija la siguiente coordenada en la ventana de diálogo. Para los montajes de SerialEM, en cada coordenada de muestreo, vaya a Archivo y elija Nuevo montaje en el menú desplegable.
Seleccione el número correcto de teselas y el porcentaje de superposición en la ventana de diálogo. Para el presente estudio, un aumento de 5000 es suficiente para reconocer las características sinápticas en el estudio. Pero el campo de visión limitado de la cámara CCD requería hacer montajes de dos por dos imágenes.
Los montajes están hechos para SerialEM. Antes de grabar cada montaje, reajuste el enfoque o active la opción de enfoque automático en el software de grabación. Elija la carpeta para guardar el archivo de montaje e inicie la grabación del montaje pulsando Inicio en el submenú de montaje, a la izquierda en SerialEM.
Inicie el microdissector y defina el tamaño del marco de recuento y el número de segmentos según sea necesario. Cuente la densidad de la sinapsis utilizando la macro de dissector. Con la herramienta multipunto ubicada en la barra de herramientas, limite las sinapsis que se intersecan con las dos líneas prohibidas del dissector, pero cuente las sinapsis en las líneas de aceptación opuestas.
Marque cada sinapsis dentro del marco de recuento que esté visible en la sección de referencia, pero no visible en la sección de búsqueda, con una selección ovalada. Para medir los parámetros de la sinapsis, seleccione solo las sinapsis con una hendidura sináptica orientada en sección transversal que se encuentra en la sección de referencia. Esto debe estar dentro de los mismos marcos de imagen utilizados para el dissector.
A continuación, vaya a Plugins y luego a Analizar e inicie el plugin ObjectJ desde el menú desplegable. Abra un nuevo proyecto desde el cuadro de diálogo desplegable ObjectJ que abrirá una ventana que permite al usuario esbozar y marcar estructuras con la herramienta de marcador. En primer lugar, utilice la herramienta de marcador para medir la longitud de la membrana presináptica y la longitud de densidad postsináptica dibujando una línea a lo largo de la estructura.
A continuación, obtenga el ancho medio de la hendidura sináptica dibujando un polígono, cubriendo tanto la membrana pre y post-sináptica. Para determinar el número de vesículas acopladas, cuente todas las vesículas que tengan una distancia máxima de la membrana presináptica de un diámetro de vesícula o menos. A continuación, determine el número de vesículas desacopladas contando las vesículas con una distancia máxima de un diámetro de vesícula desde vesículas ancladas u otras vesículas desacopladas en la misma sinapsis.
Una versión adaptada del protocolo permite análisis elementales en ubicaciones obtenidas de forma imparcial dentro de la sección ultra delgada. Para ello, en el modo de imagen TEM, inicie SerialEM y abra un nuevo proyecto. A continuación, abra el Navegador y compruebe la configuración de la cámara en los controles de cámara y script para ver y grabar e iniciar vista.
Para crear un mapa de esquina de la sección ultra delgada, elija Agregar puntos en la ventana Navegador. A continuación, establezca los puntos de esquina en los bordes de una sección ultra delgada. Mueva el escenario a un punto de esquina manteniendo pulsada la tecla derecha del ratón.
Cuando se alcance una esquina de la sección, agregue un punto de esquina con un clic izquierdo del ratón. Repita el procedimiento para agregar tres puntos de esquina más. Asegúrese de que en la ventana Navegador, la casilla C para los puntos de esquina esté marcada para los puntos almacenados.
Para iniciar el montaje de esquina, vaya a Navegador en la barra de menús de SerialEM y elija Cuadrículas de montaje y Montaje de esquina de configuración en el menú desplegable. Elija Agregar polígono en la ventana Navegador y delinee la región de interés con varios clics derecho del ratón. A continuación, elija Añadir cuadrícula de puntos en el menú desplegable Navegador y defina una distancia entre los puntos.
Inicie el script EFTEMSerialEM, siga los comandos de script, introduzca el número de puntos de cuadrícula como se muestra en el Navegador e introduzca el número de puntos de adquisición. A continuación, establezca el umbral de iluminación para que el script pueda evitar las barras de cuadrícula. Siga los comandos de script y mueva la etapa manualmente para cubrir el campo de visión en un cuarto de la barra de cuadrícula.
Según el valor mostrado, introduzca un valor de iluminación de umbral superior al valor mostrado. Espere hasta que se seleccionen los puntos para la adquisición y finalice la rutina de cocción. Esto toma mucho tiempo y se puede hacer de la noche a la mañana.
Después de configurar el análisis elemental TEM filtrado por energía, adquiera un mapa elemental con ajustes específicos del elemento. El enfoque de muestreo imparcial es útil para contar y analizar características sinápticas en regiones cerebrales específicas. Además, el script EFTEMSerialEM para el software SerialEM permite elegir aleatoriamente los puntos de adquisición dentro de una sección completamente ultra delgada, con el objetivo de obtener un micrografo electrónico filtrado por energía en cada uno de estos puntos.
El script seleccionó aleatoriamente una serie de puntos, predefinidos por el usuario de los marcados con una calificación. Al producir un micrográfico de prueba y comprobar sus niveles de grado, el script comprobó si los puntos elegidos estaban situados en una parte visible de la sección, rechazando los puntos que aterrizaron en las barras de cuadrícula. La mayor parte del flujo de trabajo se controló mediante el script, con una interacción mínima del usuario.
Sin embargo, con la muestra mostrada aquí, había muy poca luz para la rutina de enfoque automático de SerialEM. Por lo tanto, tan pronto como el script movió la etapa a cada punto, el enfoque se ajustó y se hizo un mapa elemental de hierro. Es importante seleccionar cuidadosamente la región de interés y asegurarse de que el mismo número de puntos de muestreo cae en cada área de interés.
No olvide que muchos de los productos químicos utilizados para la preparación de muestras son tóxicos. Así que use una bata de laboratorio y guantes de protección y trabaje bajo una cubierta de humos.
