Nuestro nuevo protocolo realmente nos permite visualizar estructuras celulares en 3D mediante el uso de tomografía computarizada de rayos X. Y lo hacemos manchando el tejido con eosina y de esa manera hacemos visible el citoplasma. Además de las aplicaciones médicas y la investigación, también pensamos que nuestro método se puede aplicar en biología como, por ejemplo, la investigación de zoología o la biología del desarrollo.
La técnica es relativamente sencilla, muy rápida y también adecuada para muestras de tejido más grandes. Creemos que nuestro enfoque combinado con la tomografía microcódica de rayos X puede integrarse en el flujo de trabajo clínico y luego ayudar a los patólogos a tomar mejores decisiones. Comience fijando las muestras de tejido blando.
Llene un tubo centrífugo de 50 mililitros con una solución fijativa que contenga 9,5 mililitros de 4% de formaldehído y 0,5 mililitros de ácido acético glacial. Agregue la muestra de tejido blando al tubo centrífugo y refrigída durante 24 a 72 horas. Después de la refrigeración, lave la muestra de tejido blando con la solución DPBS durante una hora.
A continuación, manche la muestra colocándola en dos mililitros de solución de tinción de Eosin Y e incubarlo en una placa de agitación horizontal durante 24 horas. Al día siguiente, saque cuidadosamente la muestra de tejido blando del recipiente de la muestra y elimine el exceso de agente de tinción con papel de tejido de celulosa. Colóquelo en un recipiente cónico por encima de una fase de vapor de etanol para su almacenamiento y uso posterior.
Prepare un soporte de muestra adecuado para montar la muestra de tejido blando de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y asegurar un ajuste ajustado para evitar que la muestra se mueva durante las mediciones de TC de rayos X. Una vez que el adhesivo se haya endurecido y el portacuchillas esté listo para usar, transfiera el riñón del ratón al tubo de centrífuga intacto que contiene unas gotas de 70% de etanol en la parte inferior. Coloque la muestra montada en el escáner de TC de rayos X.
Después de alinear cuidadosamente la muestra, elija los parámetros de adquisición para obtener la mejor calidad de imagen. Para los datos de micro CT presentados, adquiera el escaneo a una tensión máxima de 50 kilovoltas y una corriente de 3,5 vatios utilizando proyecciones 1601 igualmente distribuidas en 360 grados. A continuación, utilice los datos de micro TC de la exploración de visión general para seleccionar la región de interés para la tomografía computarizada de alta resolución.
Preparar volúmenes de interés de la muestra de tejido blando cortándola en trozos muy pequeños de aproximadamente 0,5 milímetros de longitud de borde utilizando un bisturí y un microscopio estéreo. Si usa un riñón de ratón, córtelo en dos mitades a lo largo del eje más largo. Tome la mitad y prepare diferentes regiones anatómicas como una corteza renal y una médula renal.
Transfiera las piezas pequeñas a un nuevo plato de Petri para la deshidratación. Deshidratar las muestras utilizando una serie de soluciones de etanol de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, realizando cada paso de deshidratación durante una hora. Transfiera las muestras deshidratadas a la cápsula microporosa y ciérrela.
Mantenga las muestras en contacto con 100% etanol en todo momento. A continuación, punto crítico secar las piezas de tejido pequeño. Una vez preparadas las muestras de tejido, guárdalas en un nuevo plato de Petri almacenado en un desecador antes de su uso posterior.
Monte las piezas de tejido en un soporte de muestra adecuado, lo que garantiza un ajuste ajustado. Para un riñón de ratón, superpege las piezas a un soporte de muestra utilizando un microscopio estéreo. Después de una alineación cuidadosa de la muestra, elija los parámetros de adquisición para obtener la mejor calidad de imagen.
Para los datos de nano-CT presentados, adquiera proyecciones a una tensión máxima de 60 kilovoltas con 1599 proyecciones distribuidas por igual en 360 grados y un tamaño de vóxel de aproximadamente 400 nanómetros. Este protocolo se utilizó para la visualización 3D de estructuras de tejido microscópico de un riñón de ratón. Las mediciones de micro TC de baja resolución permitieron una visión general de todo el órgano y ayudaron a identificar volúmenes de interés para mediciones de alta resolución.
El mismo riñón de ratón se utilizó para obtener datos de micro TC de alta resolución. Se logra una visión más detallada de las estructuras anatómicas como la corteza, la médula externa y la médula interna entre otras. Un volumen de representación de intereses muestra la región de la médula y una sección virtual a través del recipiente.
El nano-CT se utilizó para obtener una vista detallada de la muestra de riñón a nivel celular. Se utilizó un pequeño trozo de tejido obtenido de todo el riñón del ratón para tomar imágenes de las gruesas extremidades ascendentes del lazo de Henle con un tamaño de voxel de unos 400 nanómetros. Se realizó un estudio comparativo para garantizar que el nano-CT sea totalmente compatible con la histopatología.
El enfoque de imágenes multimodales confirmó los resultados obtenidos con ambos métodos. Durante el paso de incubación es crucial que la muestra esté completamente rodeada por la solución de tinción. También al realizar imágenes por rayos X por TC, el hecho más importante es garantizar la estabilidad de la muestra durante la adquisición de datos.
Las muestras de tejido blando que se han analizado con nuestro protocolo se pueden analizar más a fondo utilizando la técnica histológica estándar, como la contramanchato de hematoxilina. Nuestro protocolo de tinción estará contribuyendo sustancialmente al avance de la histología de rayos X 3D. La investigación médica se beneficiará especialmente de esta técnica de imagen 3D no destructiva.
