Este método proporciona una alternativa al procedimiento convencional de etiquetado de fluorescencia y análisis de citometría de flujo, que consume mucho tiempo, son costosos e incurren en el riesgo de alterar la función celular de las muestras. La principal ventaja de esta técnica es que la tomografía de índice de refracción tridimensional y el aprendizaje automático son métodos cuantitativos y libres de etiquetas que permiten una identificación rápida y precisa de linfocitos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de cánceres de sangre y enfermedades autoinmunes, ya que la identificación de linfocitos puede ser crucial para el diagnóstico de la enfermedad y la aplicación adecuada del tratamiento.
Aunque este método puede proporcionar información sobre las poblaciones de linfocitos, también se puede aplicar al análisis de otras células individuales de interés, incluidas las bacterias. La demostración visual de la tecnología de imágenes de fase cuantitativa 3D es fundamental, ya que facilita una instrucción clara de cómo realizar la técnica y puede proporcionar información sobre sus aplicaciones. Comience por recoger cada subconjunto de linfocitos mediante la clasificación celular activada por fluorescencia.
Para obtener imágenes óptimas, diluya cada muestra de célula a una concentración de 180 células por microlitro de medio RPMI e inyecte lentamente 120 microlitros de la primera muestra diluida en una cámara de imágenes. Después de confirmar la falta de burbujas dentro de la cámara, coloque una gota de agua destilada en la lente objetivo de un microscopio de fase cuantitativa 3D y coloque la cámara de imágenes en la etapa de traducción del microscopio. Ajuste el escenario de modo que la muestra se alinee con la lente objetivo y haga clic en el enfoque y la superficie en la pestaña de calibración de la perspectiva del microscopio del software de imágenes para ajustar las posiciones axiales de las lentes objetivo y condensador, respectivamente.
Haga clic en Modo automático para alinear las lentes objetivo y de condensador. Para optimizar la alineación, abra el modo de escaneo y ajuste manualmente las lentes para alinear el patrón de dispositivo de microespema digital con el centro. A continuación, vuelva al modo Normal y ajuste la etapa de traducción para localizar una celda en el campo de visión.
Ajuste la posición axial de la lente objetivo para encontrar el plano focal hasta que el límite de la muestra visualizado en la pantalla sea casi invisible. Es importante ajustar perfectamente el enfoque de la célula para generar un tomograma 3DRI óptimo. Si la imagen no se toma correctamente, la reconstrucción 3D se verá afectada, lo que resultará en un tomograma ruidoso.
Ajuste la etapa de traducción para encontrar una ubicación sin una celda y haga clic en Calibrar para medir varios hologramas 2D con diferentes ángulos de iluminación. Ajuste la etapa de traducción para localizar una celda en el centro del campo de visión. Y en la pestaña Adquisición, asigne un nombre al ejemplo que se está realizando.
Haga clic en Instantánea 3D para medir los hologramas de la celda utilizando los mismos ángulos de iluminación que para los hologramas 2D que se acaban de medir. Cuando los datos adquiridos aparezcan en el panel Administración de datos, haga clic con el botón derecho en los datos y haga clic en Procesar para reconstruir un tomograma de índice de refracción 3D a partir de los hologramas 2D utilizando el algoritmo de tomografía por defracción implementado en el software de imágenes. Después de realizar imágenes, en el panel Administración de datos, haga clic con el botón derecho en los datos y haga clic en Abrir para visualizar los datos.
Haga clic en el centro de la celda para cambiar su posición y haga clic en Ri Tomogram en el panel Administrador de datos. En la pestaña Preset, haga clic en Cargar y haga doble clic en lymphocyte. xml, que es una función de transferencia predefinida proporcionada por el software de imágenes para visualizar el tomograma de acuerdo con las distribuciones 3DRI.
Desplácese por el ratón para acercar y arrastre la celda para girarla en cualquier dirección. Para la extracción cuantitativa de características morfológicas y bioquímicas, coloque todos los datos tomográficos en una sola carpeta y divida los tipos de celda dentro de subcarpetas individuales en la carpeta principal. A continuación, abra el archivo de extracción de entidades suplementarias en el software de imágenes adecuado y edite la línea 14 para designar la carpeta tomogram de la que se extraerán los datos.
Edite la línea 15 para designar la carpeta en la que se guardarán los datos de entidad extraídos y ejecute el código. Para cada tomograma del conjunto de datos, el código calculará el área de superficie, el volumen celular, la esfericidad, la densidad de proteínas y la masa seca por umbral de índice de refracción. Para el aprendizaje supervisado y la identificación, utilice el algoritmo de división aleatoria simple en MATLAB para dividir aleatoriamente los datos de entidades extraídos en carpetas de entrenamiento y conjunto de pruebas independientes.
Abra el archivo de entrenamiento suplementario y edite la línea 14 para designar la carpeta del conjunto de entrenamiento, la línea 16 para designar la carpeta para guardar el clasificador entrenado y la línea 17 para establecer un nombre de archivo para el clasificador. A continuación, ejecute el código. Usando las características seleccionadas del conjunto de entrenamiento, el código entrenará un clasificador con el algoritmo de vecino K más cercano y guardará el clasificador en la carpeta designada.
A continuación, abra el archivo de prueba suplementario tres y edite las líneas 14 a 15 para designar el clasificador entrenado que se probará y la línea 17 para designar el conjunto de pruebas entrenado. A continuación, ejecute el código. El clasificador identificará los tipos celulares de los linfocitos individuales en el conjunto de pruebas.
Aquí se muestran los tomogramas representativos de índice de refracción renderizado en 3D de linfocitos B, linfocitos T positivos CD4 y linfocitos T positivos CD8 con diferentes esquemas de color, asignados según los valores del índice de refracción asignados a través del software de imágenes. A partir de los valores del índice de refracción se pueden calcular las características morfológicas y bioquímicas cuantitativas. En este experimento, la precisión de la clasificación de linfocitos T y B fue del 93,15% y del 89,81% para los casos de entrenamiento y prueba, respectivamente.
Los linfocitos T positivos CD4 y CD8 se clasificaron estadísticamente, y la precisión fue del 87,41% y del 84,38% para los conjuntos de entrenamiento y pruebas, respectivamente. Por último, la precisión del clasificador de tipo de celda multiclase fue del 80,65% y del 75,93% para las etapas de entrenamiento y prueba, respectivamente. La calidad y el número de imágenes son esenciales para el éxito de esta técnica.
Cuanto mejor sea la calidad de la imagen y mayor sea el volumen de datos, mejor será la precisión de la identificación. El aprendizaje profundo se puede utilizar para analizar más completamente los datos complejos de los tomogramas, mejorando en gran medida el rendimiento de identificación. Además, la fluorescencia y las imágenes de fase cuantitativa 3D se pueden utilizar para investigar la trayectoria de las funciones fisiológicas de los linfocitos identificados.
Después de su desarrollo esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología celular y la biomedicina exploraran enfermedades específicas de interés dentro de diferentes organismos. De hecho, los inmunólogos en particular pueden beneficiarse del uso de esta nueva tecnología para identificar la población de interés.
