Este método puede ayudar a responder preguntas clave en varios campos de investigación de enfermedades metabólicas sobre alteraciones moleculares de la energía hepática y la biosíntesis de proteínas en la obesidad, hígado graso no alcohólico, y tipo dos diabetes. Las principales ventajas de esta técnica son que facilita el aislamiento de hepatocitos primarios funcionales de ratón y la detección de proteínas nacientes hepáticas a través de un sustrato de etiquetado no radioactivo. La demostración visual de este método es crítica ya que el paso de perfusión es difícil de aprender debido a los vasos sanguíneos de ratón pequeños y delgados.
Para la perfusión hepática, inserte cuidadosamente un catéter de calibre 24 en la Vena Cava Inferior o IVC justo en la bifurcación con la vena renal derecha. Retire la aguja del catéter manteniendo la posición de la cánula dentro de la CIV y conecte una cánula de calibre 24 con un tubo de perfusión utilizando el conector. Comience a perfundir el hígado con HBSS caliente menos a un flujo permanente de cuatro mililitros cortando rápidamente la vena esplénica para drenar la sangre interna.
Después de 10 minutos, perfunda el hígado del ratón con 35 mililitros de HBSS más complementado con colágeno tipo X a un caudal de cuatro mililitros por minuto, sujetando la vena esplénica durante unos 10 segundos cada pocos minutos para facilitar la distribución del perfundido en todo el hígado. Cuando toda la colagenasa se ha perfundido, transferir el hígado a un tejido de laboratorio antes de detener la bomba para evitar el flujo de sangre en el hígado. Usa fórceps para extirpar la vesícula biliar y limpiar suavemente el hígado con un tejido de laboratorio fresco para extraer sangre.
Coloque el hígado en un plato petri de 100 milímetros que contenga cinco mililitros de HBSS fresco y cálido, además de suplementado con colágenonasa y use fórceps de punta extraviada para eliminar suavemente la cápsula hepática. Utilice los fórceps para dispersar cuidadosamente el tejido parénquima y añadir 15 mililitros de DMEM frío a la placa Petri. Agitar el hígado desgarrado suavemente para liberar las células parénquimales residuales en el medio y añadir otros 15 mililitros de DMEM frío al plato para adquirir el resto de las células.
Luego filtre la suspensión del tejido a través de un colador de células de 100 micras en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para aislar los hepatocitos primarios del ratón, recoger las células por centrifugación y resuspend el pellet en 10 mililitros de DMEM fresco. Capa cuidadosamente las celdas sobre un búfer de gradiente de densidad 40% para la separación de gradiente de densidad, descartando las células de las capas superior y media después de la centrifugación.
Resuspender el pellet de hepatocito parénquimal primario con dos a tres mililitros de William's Medium E para evitar recoger células muertas de la pared del tubo y transferir las células a un nuevo tubo de 50 mililitros. Mezcle las células con otros siete a ocho mililitros del medio E de William antes de la centrifugación y resusppend el pellet en 10, 20 o 30 mililitros de E media de William fresco dependiendo del tamaño del pellet. Después de contar, siembra seis veces 10 a las quintas células a cada pozo de un plato de seis pocillos para una incubación de dos a tres horas a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, reemplace el medio con DMEM complementado con 10%Fetal Bovine Serum y anti-anti para eliminar las células muertas y no asociadas y devolver las células a la incubadora durante la noche. Para el etiquetado de proteína naciente modificado con azida, agregue de 20 a 40 microgramos de lisato celular a 50 microlitros de tampón de reacción 2X. Lleve el volumen a 80 microlitros con agua desionizada destilada y vórtice la solución proteica durante cinco segundos.
Añadir cinco microlitros de sulfato de cobre a las células para otro vórtice de cinco segundos, seguido de cinco microlitros de aditivo de búfer de reacción uno con cinco segundos de vórtice. Después de una incubación de tres minutos, agregue 10 microlitros de aditivo de búfer de reacción reconstituido dos a las células para otro vórtice de cinco segundos y gire la muestra durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en una máquina multi-rotador protegida de la luz. Al final de la rotación, añadir 300 microlitros de metanol al ésato, seguido de 75 microlitros de cloroformo, y 200 microlitros de agua destilada doble.
Recoger la proteína etiquetada por centrifugación y añadir 250 microlitros de metanol fresco al pellet. Después del vórtice, centrifugar el izado de nuevo y cubrir el pellet desnudo con un tejido libre de pelusas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis PAGE, solubilite el pellet seco en 20 microlitros de tampón de carga sin beta-mercaptoetanol y vórtice el pellet durante 10 minutos.
A continuación, calentar la proteína en un bloque de calor de 70 grados Celsius durante 10 minutos y cargar la muestra en un 10%gel de sulfato de dodecil sódico para la detección de tetrametilrhodamina. A continuación, utilice un escáner láser de modo variable para la cuantificación precisa de las proteínas nacientes etiquetadas por AHA. Histológicamente, los hepatocitos primarios vivos y adjuntos aparecen típicamente poligonales o hexagonales en forma con un límite membranoso claramente esbozado después de 24 horas de cultivo.
Para confirmar si las células aisladas son hepatocitos primarios, en este experimento, se compararon los niveles de expresión de proteína de albúmina en fibroblastos embrionarios de ratón, una línea celular de hepatoma de ratón, hepatocitos primarios aislados de ratón y hígados de ratón. La expresión de la proteína albúmina se detectó en hepatocitos primarios de ratón e hígados de ratón, pero no era detectable ni en fibroblastos embrionarios de ratón ni en células de línea celulares de hepatoma. El tratamiento primario de hepatocitos con 10 rotenona micromolar durante cuatro a seis horas reveló una inducción robusta de la proteína quinasa activada por AMP hepático, tal como se detectó mediante el aumento de los niveles de fosforilación en la proteína quinasa T172 activada por AMP hepático similar a las observadas in vivo.
De hecho, cinco horas de tratamiento con 10 micromolares de rotenona tuvieron profundos efectos inhibitorios sobre la síntesis de proteínas nacientes en hepatocitos primarios tratados en comparación con las células de control no tratadas, como lo demuestra un ensayo de reacción de ligadura quimioselectiva. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar todos los reactivos y medios necesarios con antelación. Esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la fisiopatología metabólica hepática explorara el mecanismo molecular de la regulación de proteínas energéticas en la obesidad y la diabetes tipo dos en el hepatocito primario aislado de ratón.
