Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacunación de la mucosa, como cómo la mucosa intestinal captar compuestos biológicos y cómo estos biológicos modulan el sistema inmunológico en el sitio local después de la intubación. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de configurar, rápido y muestra bajas tasas de mortalidad. Este método puede proporcionar información sobre la vacuna mucosa.
También se puede aplicar a otros compuestos, tales como productos químicos, tóxicos, o patógenos. La demostración visual de este método es crítica ya que en los pasos de intubación oral y disección intestinal, es necesario tener cuidado porque en la intubación se podría lesionar el pez cebra y causar la muerte. En la disección, el extremo del intestino es muy fino y frágil.
Coloque aproximadamente un centímetro de tubo de silicona fino en una aguja Luer-lock de calibre 31. Corte una punta de pipeta de filtro estéril de 10 microlitrotros, tome el extremo más fino y colóquelo sobre el tubo de silicona como una vaina. Para empezar, conecte el aparato de aguja a una jeringa Luer-lock de 100 microlitrotros.
Primero, mueve el pez a los tanques experimentales una noche antes del experimento. Vórtice bien la solución de nanopartículas preparada y extraiga el volumen deseado de la suspensión. Después de anestesiar el pescado de forma segura, utilice una red para transferir rápidamente el pescado a una bandeja de plástico húmeda.
Oriente al animal horizontalmente para que esté frente a la aguja. Apoyar cuidadosamente el pescado con una mano, y abrir la boca con la aguja protegida. Luego, inserte suavemente la aguja por el esófago a aproximadamente un centímetro de la abertura de la boca.
Es difícil ver hasta dónde debe llegar la aguja, y esto es una cuestión de práctica. Usted sentirá la aguja como encuentra una parada, y luego al manipular la aguja, encontrará el ángulo correcto para insertar el dispositivo un poco más. Inyecte lentamente la suspensión de nanopartículas en el pez, asegurando que la suspensión no fluya hacia afuera a través de las branquias o la boca.
Después de esto, retire suavemente la aguja y coloque el pez en un tanque de recuperación. Mientras el pez se recupera, monitorea a los peces para detectar cualquier anomalía. Una vez que el pez se haya recuperado, devuélvelo a uno de los tanques experimentales.
Después de eutanasiar el pescado de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el pescado en un pedazo de papel de filtro. Usando tijeras de disección afiladas, haga una incisión semicircular desde el ano hasta el opérculo, y abra la incisión con pinzas finas. Luego, corte ambos extremos del intestino, saque todos los órganos internos y colóquelos en el papel de filtro.
A continuación, separar el intestino de los órganos internos, y estirarlo, teniendo cuidado de obtener todo el intestino. Por último, use pinzas para enrollar el intestino sobre el papel del filtro para separar el tejido adhesivo. Usando este protocolo, el pez cebra de sexo mixto fue intubado con éxito con diferentes nanopartículas de proteína recombinante.
Utilizando el dispositivo de intubación oral casero, se logró un bajo porcentaje promedio de mortalidad. Para evaluar la entrega de los cuerpos de inclusión de nanopartículas fluorescentes realizados con TNF alfa recombinante, se realizó un análisis de citometría. La cantidad total de células fluorescentes fue significativamente mayor en el grupo intubado de nanopartículas que en el grupo de control cinco y 24 horas después de la intubación.
El equipo de intubación es barato, preciso y reutilizable. Todo el procedimiento de intubación puede ser realizado muy rápidamente por un operador, y, lo que es importante, el método es consistente entre diferentes operadores. La combinación de nuestro método de intubación con el análisis posterior podría ser ideal para el desarrollo de vacunas orales.
