この方法は、腸管粘膜が生物学的化合物をどのように取り込むか、そのような生物学的が挿管後の局所部位で免疫系を調節する方法など、粘膜空洞化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、セットアップが簡単で、迅速で、低い死亡率を示していることです。この方法は、粘膜のワクチン接種に関する洞察を提供することができる。
また、化学物質、毒性、病原体などの他の化合物にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、口腔挿管と腸管解剖のステップのように重要であり、挿管ではゼブラフィッシュを傷つけ、死を引き起こす可能性があるため、注意する必要があります。解剖では、腸の終わりは非常に細かく、壊れやすいです。
31ゲージのルアーロック針に約1センチの細かいシリコンチューブを置きます。滅菌10マイクロリットルフィルターピペットチップをカットし、より細かい端を取り、シースとしてシリコーンチューブの上に置きます。まず、針装置を100マイクロリットルのルアーロックシリンジに取り付けます。
まず、実験の1晩前に魚を実験タンクに移動します。調製したナノ粒子溶液をうまく渦巻き、懸濁液の所望の容積を引き出す。魚を安全に麻酔した後、網を使って魚を濡れたプラスチックトレイに素早く移します。
針に向くように動物を水平方向に向けます。慎重に片手で魚をサポートし、保護された針で口を開きます。その後、口の開口部から約1センチメートルまで食道に針をそっと挿入します。
針がどこまで進むべきかを見るのは難しく、これは練習の問題です。あなたは、それが停止を見つけると針を感じ、その後、針を操作することによって、あなたはもう少しデバイスを挿入するための正しい角度を見つけるでしょう。ナノ粒子懸濁液をゆっくりと魚に注入し、懸濁液がエラや口を通って外側に流れないようにします。
その後、針をそっと取り出し、魚を回収槽に入れます。魚が回復している間、異常がない場合は魚を監視します。魚が回復したら、実験用タンクの1つに戻します。
テキストプロトコルに従って魚を安楽死させた後、フィルターペーパーの上に魚を置きます。鋭利な解剖はさみを使用して、アヌスからオーペルキュラムへの半円形切開を行い、細かいピンセットで切開を開きます。次に、腸の両端を切り、すべての内臓を取り出し、濾紙の上に置きます。
次に、腸を内臓から分離し、それを伸ばし、すべての腸を得るように注意を払う。最後に、ピンセットを使用して濾紙の腸を転がし、粘着組織を取り外します。このプロトコルを用いて、混合性のゼブラフィッシュは、異なる組換えタンパク質ナノ粒子で正常に挿管された。
自家製の口腔挿管装置を用いて、死亡率の平均割合が低かった。組換えTNFαを用いて作製した蛍光ナノ粒子封入体の送達を評価するために、サイトメトリー分析を行った。蛍光細胞の総量は、挿管後5時間および24時間後の対照群よりもナノ粒子挿管群において有意に高かった。
挿管装置は安価で精密で再利用可能です。挿管手順全体は、1 つの演算子で非常に迅速に行うことができます。当社の挿管法と下流分析の組み合わせは、経口ワクチン開発に理想的です。
