Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da vacinação da mucosa, como como a mucosa intestinal capta compostos biológicos e como tais biológicos modulam o sistema imunológico no local após a intubação. A principal vantagem dessa técnica é que é simples de configurar, rápido e mostra baixas taxas de mortalidade. Este método pode fornecer informações sobre a vacinação mucosa.
Também pode ser aplicado a outros compostos, como produtos químicos, tóxicos ou patógenos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois nas etapas de intubação oral e dissecção intestinal, é preciso ter cuidado porque na intubação você pode ferir o zebrafish e causar a morte. Na dissecção, a extremidade do intestino é muito fina e frágil.
Coloque aproximadamente um centímetro de tubo de silicone fino em uma agulha de bloqueio Luer calibre 31. Corte uma ponta de pipeta de filtro de 10 microliter estéril, pegue a extremidade mais fina e coloque-a sobre o tubo de silicone como uma baia. Para começar, conecte o aparelho da agulha a uma seringa luer-lock de 100 microliter.
Primeiro, mova o peixe para os tanques experimentais uma noite antes do experimento. Vórtice a solução de nanopartículas preparada bem, e elaborar o volume desejado da suspensão. Depois de anestesiar com segurança o peixe, use uma rede para transferir rapidamente o peixe para uma bandeja de plástico molhada.
Oriente o animal horizontalmente para enfrentar a agulha. Apoie cuidadosamente o peixe com uma mão e abra a boca com a agulha protegida. Em seguida, insira suavemente a agulha pelo esôfago a cerca de um centímetro da abertura da boca.
É difícil ver até onde a agulha deve ir, e isso é uma questão de prática. Você sentirá a agulha quando ela encontrar uma parada, e então, manipulando a agulha, você encontrará o ângulo correto para inserir o dispositivo um pouco mais. Injete lentamente a suspensão da nanopartícula no peixe, garantindo que a suspensão não flua para fora através das brânquias ou da boca.
Depois disso, retire suavemente a agulha e coloque o peixe em um tanque de recuperação. Enquanto o peixe se recupera, monitore o peixe para qualquer anormalidade. Uma vez recuperado o peixe, devolva-o a um dos tanques experimentais.
Depois de eutanásia do peixe de acordo com o protocolo de texto, coloque o peixe em um pedaço de papel filtro. Usando uma tesoura de dissecção afiada, faça uma incisão semi-circular do ânus até o operículo, e abra a incisão com pinças finas. Em seguida, corte as duas extremidades do intestino, tire todos os órgãos internos e coloque-os no papel do filtro.
Em seguida, separe o intestino dos órgãos internos, e estique-o, tomando o cuidado de obter todo o intestino. Por fim, use pinças para enrolar o intestino no papel filtro para desprender o tecido adesivo. Usando este protocolo, os zebrafish de sexo misto foram entubados com sucesso com diferentes nanopartículas de proteína recombinante.
Utilizando-se o dispositivo de intubação oral caseiro, foi alcançada uma baixa porcentagem média de mortalidade. Para avaliar a entrega dos corpos de inclusão de nanopartículas fluorescentes feitas com tnf alfa recombinante, foi realizada uma análise de citometria. A quantidade total de células fluorescentes foi significativamente maior no grupo intubado por nanopartículas do que no grupo controle, cinco e 24 horas após a intubação.
O equipamento de entubação é barato, preciso e reutilizável. Todo o procedimento de intubação pode ser feito muito rapidamente por um operador e, importante, o método é consistente entre diferentes operadores. A combinação do nosso método de intubação com análise a jusante pode ser ideal para o desenvolvimento de vacinas orais.
