Кишечно-кровавый барьер является многослойной системой, которая контролирует прохождение питательных веществ, бактериальных метаболитов, лекарств и других экзогенных соединений из кишечного люмена в кровоток. Как известно, целостность барьера может быть нарушена как в желудочно-кишечном тракте, так и при сердечно-сосудистых и некоторых метаболических заболеваниях, которые могут привести к облегчению доступа биологически активных соединений, таких как кишечные бактериальные метаболиты, к кровотоку и могут повлиять на функционирование всего организма. Поэтому проницаемость кишечно-кровавого барьера может быть маркером как кишечных, так и экстра кишечных заболеваний.
В этом видео мы представляем прямое измерение проницаемости кишечно-кровавого барьера у крыс с помощью портативной выборки крови после введения испытательного вещества в пищеварительный тракт. Мы подробно описываем категоризацию вены портала и нижней вены кавы чуть выше слияния печеночными венами. Анализ крови из портвейна вены и нижней вены cava позволяет оценить не только проницаемость гемато-гематоцита, но и печеночную очистку и поглощение молекул, представляющих интерес, таких как метаболиты кишечных бактерий или лекарства.
Этот метод практически не зависит от функции печени и почек и сохраняет кишечный кровоток, который является сильным преимуществом по сравнению с широко используемыми in vivo и in vitro методами. Перед процедурой животных следует поститься всю ночь. Выполняем все процедуры во время общей анестезии.
После эксперимента животных усыовызяются. Наша процедура начинается с вставки линии для внутрикишечного введения. Здесь мы предлагаем внутриколоничную администрацию маркера.
Это может быть изменено администрацией на различных уровнях пищеварительного тракта. Например, желудок или двенадцатиперстная боль. Однако, принимать во внимание переменную скорость перистализа и возможные взаимодействия с ферментами и желудочными кислотами при введении маркера в верхние части желудочно-кишечного тракта.
Используйте педиатрический катетер Фоли размером 10 F или 8 F в качестве катетера толстой кишки. Отметьте катетер, чтобы указать часть, которая будет вставлена в толстую кишку примерно восемь сантиметров. Проверьте анальный регион и количество стула в прямой кишке перед вставкой катетера в толстой кишке.
Если стул присутствует, опорожните прямую кишку, массируя ректальной области. Положите смазку вдоль катетера. Затем смочить анус и его окрестности с помощью смазки.
Вставьте катетер с направляющий провод через внешний анальный сфинктер. Сделайте медленно вперед, назад и круговыми движениями. Продолжайте проверять расположение катетера путем пальпации брюшной полости при вставке катетера.
Следующим шагом является нижняя вена cava катетеризации. Вы можете пропустить эту процедуру в кишечнике проницаемости исследований. Попробуйте почувствовать пульс на бедренной артерии и вырезать кожу продольно на длину около двух сантиметров в месте, где пульс ощутим.
Вскрыть фасции и мышц для визуализации нервно-сосудистых расслоение. Затем вскрыть бедренную вену из нервно-мышечной расслоения. Сначала нервы, потом бедренная артерия, а затем вена.
Будьте осторожны во время вскрытия пучка, так как несколько крошечных ветвей бедренной вены могут быть легко повреждены. Затем положите две лигатуры на бедренную вену. Пока не завязывай узлы.
Поймать концы проксимальной лигатуры с держателем иглы. Затем осторожно потяните лигатуру заканчивается держателем вверх, чтобы закрыть проксимальную часть вены. Подождите, пока вена не заполнится кровью и свяжут дистальный узел.
Затем сделайте небольшой разрез на вену между узлом и проксимальной лигатурой с помощью микрохирургических ножниц. Затем вставьте катетер с помощью пинцета или иглы с изогнутым концом, как мы делаем в видео. Проколите вену и используйте изогнутый кончик иглы в качестве руководства для катетера.
Ослабить проксимальную лигатуру при вставке катетера. Вставьте катетер примерно на шесть-семь сантиметров в зависимости от размера животного, чтобы поместить проксимальный кончик катетера в нижняя кава вены чуть выше слияния печеночными венами. Правильное размещение катетера должно быть подтверждено после эксперимента.
Защитите катетер в бедренной вене двумя одиночными хирургическими узлами. Свяжите проксимальную лигатуру также. Проверьте проходимость катетера, пытаясь извлечь кровь шприцем.
Промыть катетер с 0,3 миллилитров гепаринизированного солевого раствора. Закройте хирургическую рану двумя слоями одиночных швов. Теперь перейдем к катетеризации вен портала.
Подготовь портал катетера. Состоит из иглы, гибкого полиуретанового катетера, гибкого полиэтиленового кончика катетера, вилки и лигатуры. Первым этапом процедуры является выполнение лапаротомии средней линии.
После подготовки операционного поля, вырезать кожу продольно от xiphoid грудины до пупка. Вырезать мышцы брюшной стенки вдоль белой линии. Далее, расширить разрез rostrally в форме у так, что xiphoid хряща между двумя разрезами.
Следующим шагом является портал вены вскрытия. Во-первых, смочить тампоны солевым раствором. А затем экстерьер cecum, восходящей и поперечной толстой кишки, и тонкой кишки петли.
Положите кишечник на левую сторону, чтобы разоблачить корень мезентерии. Обложка кишечника с марлей увлажненной с физиологическим солевым раствором, чтобы защитить их от высыхания. Чтобы разоблачить портал вены двигаться осторожно печеночных долей в стороны или вверх к диафрагме с увлажненными тампонами.
Здесь мы можем увидеть портал вены и верхней мезентерической вены. Локализируйте часть портала вены, которая не покрыта мезентерией, и передайте лигатуру под порталной вены. Чтобы защитить ткани от повреждений, смочить лигатуру физиологическим солевым раствором.
Зажим с силами концы лигатуры и затянуть его осторожно, чтобы стабилизировать сосуд. Передавайте более длинную часть лигатуры катетера под свободной частью вены портала и потяните ее так, чтобы катетер располагался рядом с порталной веной. Вставьте иглу в верхнюю мезентерическую вену на три миллиметра ниже стыка верхней мезентерической вены и портной вены.
Держите иглу под углом 30 градусов и после ввода в вену уменьшить угол и заранее иглы почти горизонтально параллельно портал вены длиной около шести до семи миллиметров. Нанесите одну или две капли ткани клея на месте, где игла вставляется. Удалите тампоны, которые покрывали печень.
После этого положить кишечник обратно в брюшную полость. Смочить кишечник разогретым солевым раствором и накрыть его увлажненной стерильной марлей. Проверьте проходимость катетера и промойте катетер гепаринизированным солевым раствором.
Венозная кровь спонтанно возвращается в катетер. Через пять минут проверьте цвет кишечника и перистальтические движения, чтобы убедиться, что надлежащий мезентерический кровоток поддерживается. В конце концов, закрыть брюшную полость с тремя слоями стежков экстерьеризации дистальной части катетера вокруг пупка.
Чтобы собрать кровь из вены портала, откройте портал катетера штепсельной вилкой и дайте крови свободно течь. Используйте шприц и тупую иглу и соберите не более 0,7 миллилитров крови. Промыть катетер гепаринизированным солевым раствором и закрыть вилку катетера.
Здесь мы представляем образцовые протоколы отбора проб крови портала для оценки проницаемости кишечника. Образцы крови из нижней кавы вены необходимы для печеночных исследований очистки и поглощения. Сбор крови из нижней вены кавы происходит точно так же, как при приеме крови из портвейна вены.
Здесь мы представляем образцовый протокол отбора проб крови для измерения расчистки печени и для отслеживания кишки-портал крови печени системного пути крови отдельных соединений. В наших исследованиях мы использовали бактериальный метаболит, триметиламин в качестве маркера проницаемости. Однако многие другие вещества, включая маркеры проницаемости класса могут быть использованы также.
Различные бактерии и метаболиты и трактаты могут быть также использованы для трактовки пути поглощения или печеночным клиренсом. Удалите направляющий провод и надуть воздушный шар, используя достаточный объем стерильной воды, как правило, один миллилитр, но проверить на самом деле размер шара перед вставкой. Диаметр воздушного шара не должен превышать одного сантиметра.
Поместите голову крысы вниз, чтобы свести к минимуму риск оттока вводимого раствора из толстой кишки. Медленно ввестировать испытанное вещество с помощью дренажного порта и катетера толстой кишки. Мы использовали триметиламин в дозе 100 миллиграммов на килограмм массы тела, растворенного в 0,7 миллилитров солевого раствора.
Через десять минут сдуть катетер воздушный шар. Печеночная клиренс, понятый как печеночная экстракция, может быть выражена разницей между концентрацией крови портала и низкой концентрацией вены в крови или соотношением низкой кавы и концентрации портала крови. Мы успешно измерили проницаемость гемко-кровавого барьера и очистку печени от триметиламина у крыс.
Вот репрезентативные результаты, которые показывают, что гипертонической крысы увеличили проницаемость толстой кишки до TMA по сравнению с нормотензивными крысами. В другом исследовании мы изучали ли высокое потребление соли влияет на проницаемость китро-крови барьер и печени клиренс триметиламина. Внутриколоническое введения триметиламина произвело значительное увеличение концентрации тромбоцита крови ТМА.
Размер увеличения и печеночная клиренс были схожи между группами. Мы также отслеживали путь поглощения короткой цепи жирных кислот. Мы измерили концентрацию в стуле, портвейном крови и периферической крови.
В этом видео мы описали всеобъемлющий протокол, который включает в себя прямое измерение проницаемости гемато-кровавого барьера in vivo, который, в отличие от широко используемых методов, не зависит от функций печени и почек, измерения печеночной клиренс, и в-третьих, оценка пути поглощения экзогенных соединений. Представленная техника может быть скорректирована под другие экспериментальные цели. Например, портал измерения артериального давления или введения препарата непосредственно на портале вены.
