Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia génica, la oncolisis y la vacunación genética. Facilita la comprensión y modulación de las interacciones de los hosts vectoriales de vectores de transferencia de genes de adenovirus, el tipo de vector más utilizado en ensayos clínicos actualizados. La principal ventaja de esta técnica es que los capsulados de adenovirus se pueden modificar específicamente de una manera muy definida en posiciones seleccionadas y en extensión variable mediante el uso de química simple.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia porque la modificación del huésped vectorial no sólo puede ser analizada sino también modulada de una manera orientada al paciente. Aunque este método proporciona información sobre interacciones específicas del huésped vectorial, también se puede utilizar para el etiquetado y seguimiento de partículas de virus en organismos vivos, como ratones. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán con la combinación única de Virología y Cchemistry Orgánica que requiere conocimiento práctico de ambos campos.
La demostración especial de esta técnica es fundamental porque aquí los métodos de Química Orgánica cumplen con los métodos de Biología Celular y Virología, incluyendo trucos de manejo específicos sobre el terreno. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los búferes como se describe en el protocolo de texto. Pesa un mililitro de cada búfer de gradiente para comprobar su densidad.
Después de esterilizar todos los tampones, escupe los tampones que contienen TCEP con gas argón durante unos 30 segundos para evitar la oxidación del TCEP. Almacene los viales que contienen la mitad de acoplamiento en polvo sólido en tubos más grandes, cada uno lleno con un cojín de perlas de gel de sílice, para evitar la acumulación de agua condensada al descongelar los viales. Coloque estos tubos en un desecador.
Retire el aire del desecador y sustitúyalo por gas argón. A continuación, cierre cada tubo firmemente y transfiéralo a un recipiente más grande con cuentas de gel de sílice. Una vez que todos los tubos han sido transferidos, cierre el contenedor.
Almacene el recipiente a 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Cuando esté listo para descongelar, coloque el recipiente en una capa de perlas de sílice en un desecador. Deje que el recipiente se caliente lentamente a temperatura ambiente y luego abra el recipiente.
Cuando las células alcancen el efecto citopático óptimo, recórrelas raspando las placas y transfiriendo el sobrenadante a tubos centrífugos. Gire la suspensión celular a 400 veces G durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de tampón de addlu litro que contengan 10 TCEP mili evolucionadores y transfiera la solución resultante a un tubo estéril de 50 mililitros.
Congele la solución en nitrógeno líquido y, a continuación, descongele en un baño de agua a 37 grados centígrados. Repita este ciclo de descongelación de congelación tres veces para rescatar el vector. Centrifugar a 5000 G y cuatro grados centígrados durante diez minutos.
Durante la centrifugación estableció dos tubos de centrífuga ultra para comenzar a preparar dos gradientes de paso de cloruro de cesio iguales. Añadir tres mililitros de la fase inferior a cada uno de estos tubos. Marque el nivel de la fase inferior en el tubo antes de cargar la fase superior.
Luego apilar cuidadosamente cinco mililitros de la fase superior hasta la fase inferior, pipeteándolo muy lentamente a lo largo de las paredes del tubo. Cuando se preparan los gradientes y la centrifugación es completa, cargue el sobrenadante de la muestra por igual sobre los dos gradientes. Llene el espacio restante en cada tubo de degradado con Ad-buffer que contiene diez TCEP mililarios asegurándose de llenar los tubos hasta la parte superior.
Ajuste el peso de los tubos opuestos a una diferencia de peso cero. Y alterar la centrífuga para 176000 veces G y 4 grados Celsius durante dos horas. Después de esto, utilice una abrazadera para fijar un tubo de centrifugación ultra a un soporte.
Asegúrese de dejar el área alrededor del nivel de fase inferior marcada como accesible. Coloque la lámpara de cuello de ganso por encima del tubo. Alrededor de la marca, en el borde entre las fases inferior y superior, una banda distinta debe ser visible.
Perfore el tubo con una aguja y aspire la banda vectorial en una jeringa para recoger el vector. Transfiera virones vectoriales recogidos a un tubo de 15 mililitros y calcule la cantidad de sustrato de acoplamiento necesaria como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera la solución vectorial a un tubo de tamaño adecuado.
Y la cantidad calculada de solución de stock de compuestos de acoplamiento. Mezclar suavemente por rotación superior durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, ajuste el volumen total de la solución vectorial a seis mililitros agregando el búfer de anuncios.
Purifique el vector de la mitad de acoplamiento no reaccionada utilizando un segundo paso de unión de cloruro de cesio como se describe en el protocolo de texto. Perfore el tubo con una aguja y aspire la banda vectorial en una jeringa. Transfiera los vectores recogidos a un tubo de 15 mililitros.
Si la combinación de ambos tubos de gradiente es inferior a 2,5 mililitros, ajuste el volumen a 2,5 mililitros añadiendo Ad buffer. Cargue los virones combinados en una columna Pd mejorada igual y deseche el flujo a través. A continuación, agregue tres mililitros de búfer de anuncio a la columna y recopile el flujo a través.
Añadir 333 microlitros de glicerol al flujo recogido a través de para obtener la concentración final del diez por ciento. Divida estos en alícuotas adecuadas. Asegúrese de incluir una alícuota de 20 microlitros para una determinación más estricta mediante la medición OD 260.
Almacene la solución vectorial a 80 grados centígrados hasta que esté lista para su uso. Los resultados representativos de los efectos en 293 células indican que la producción vectorial es exitosa. Las células deben mostrar morfología 40-48 horas después de haber sido inoculadas con el vector del virus.
El fago SDS teñido de plata se utiliza entonces para evaluar la eficiencia del acoplamiento. Los vectores con Cysteins introducidos en la base de pentone capsomere tanto con el hexon modificado y no modificado se ejecutan. Las bandas Hexon exhiben un cambio que indica una modificación exitosa de más del 90 por ciento de los monómeros por cálsido.
Al intentar este procedimiento es importante garantizar un entorno reductor para partículas vectoriales no indomificadas. Después de la modificación, una atmósfera regular es adecuada. Los cálculos documentales precisos tienen que garantizar la modificación cuantitativa de todas las partículas vectoriales.
El desarrollo de esta técnica ayuda a la investigación en el campo de la Terapia génica para explorar más a fondo estrategias seguras y deficientes para la entrega de vectores. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como el acoplamiento de ligandos para la orientación o colorantes fluorescentes para el etiquetado con el fin de responder a preguntas adicionales como el uso del receptor y la distribución de la bio. Por favor, asegúrese de obedecer su OMG local y las Regulaciones de Seguridad de Trabajo.
