Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da Terapia Genética, Oncolise e Vacinação Genética. Facilita a compreensão e modulação das interações de vetores dos vetores de transferência de genes adenovírus, o tipo vetorial mais usado em ensaios clínicos atualizados. A principal vantagem desta técnica é que os capsulados de adenovírus podem ser especificamente modificados de forma altamente definida em posições selecionadas e em proporção variável usando química simples.
As implicações dessa técnica se estendem para a terapia porque a modificação do hospedeiro vetorial não pode ser apenas analisada, mas também modulada de forma orientada ao paciente. Embora este método forneça informações sobre interações específicas de hospedeiros vetoriais, ele também pode ser usado para rotular e rastrear partículas de vírus em organismos vivos, como ratos. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão com a combinação única de Virologia e Cquímica Orgânica que requer conhecimento prático de ambos os campos.
A demonstração especial desta técnica é fundamental porque aqui os métodos da Química Orgânica atendem métodos da Biologia Celular e Virologia, incluindo truques de manuseio específicos de campo. Para iniciar este procedimento, prepare todos os buffers conforme descrito no protocolo de texto. Pesar um mililitro de cada tampão de gradiente para verificar sua densidade.
Depois de esterilizar todos os buffers, esparge os tampões contendo TCEP com gás argônio por cerca de 30 segundos para evitar a oxidação do TCEP. Armazene os frascos contendo o moiety de acoplamento em pó sólido em tubos maiores, cada um cheio com uma almofada de contas de gel de sílica, para evitar o acúmulo de água condensada ao descongelar os frascos. Coloque esses tubos em um dessecador.
Remova o ar no desiccator e substitua-o por gás argônio. Em seguida, feche cada tubo firmemente e transfira-o para um recipiente maior com contas de gel de sílica. Uma vez que todos os tubos tenham sido transferidos, feche o recipiente.
Armazene o recipiente a 80 graus Celsius até estar pronto para usar. Quando estiver pronto para descongelar, coloque o recipiente em uma camada de contas de sílica em um dessecante. Deixe o recipiente aquecer lentamente até a temperatura ambiente e, em seguida, abra o recipiente.
Quando as células atingirem o efeito citopático ideal, colete-as raspando as placas e transferindo o supernatante para tubos centrífugas. Gire a suspensão do celular a 400 vezes G por 10 minutos. Em seguida, suspenda a cápsula celular em quatro mililitros de tampão de anúncio contendo 10 mililitros de TCEP e transfira a solução resultante para um tubo estéril de 50 mililitros.
Congele a solução em nitrogênio líquido e descongele-a em um banho de água a 37 graus Celsius. Repita este ciclo de congelamento três vezes para resgatar o vetor. Centrífuga a 5000 G e 4 graus Celsius por 10 minutos.
Enquanto a centrifugação estabeleceu dois tubos ultra centrífugas para começar a preparar dois gradientes de passo de cloreto de césio iguais. Adicione três mililitros da fase inferior a cada um desses tubos. Marque o nível da fase inferior no tubo antes de carregar a fase superior.
Em seguida, empilhar cuidadosamente cinco mililitros da fase superior até a fase inferior, pipetando-o muito lentamente para baixo ao longo das paredes do tubo. Quando os gradientes são preparados e a centrifugação é completa carregar o sobrenante da amostra igualmente sobre os dois gradientes. Encha o espaço restante em cada tubo de gradiente com tampão de anúncio contendo dez milimões de TCEP certificando-se de encher os tubos até o topo.
Ajuste o peso dos tubos opostos para uma diferença de peso zero. E alterar centrífuga por 176000 vezes G e 4 graus Celsius por duas horas. Depois disso, use um grampo para fixar um tubo de ultra centrifugação em um suporte.
Certificando-se de deixar a área ao redor do nível de fase inferior marcado acessível. Coloque a lâmpada de pescoço de ganso acima do tubo. Ao redor da marca, na borda entre as fases inferior e superior, uma faixa distinta deve ser visível.
Puna o tubo com uma agulha, e aspire a banda vetorial em uma seringa para coletar o vetor. Transfira os vernos vetoriais coletados para um tubo de 15 mililitros e calcule a quantidade de substrato de acoplamento necessário conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira a solução vetorial para um tubo de tamanho apropriado.
E a quantidade calculada de acoplamento compostos solução de estoque. Misture suavemente por rotação aérea durante uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, ajuste o volume total da solução vetorial para seis mililitros adicionando buffer de anúncio.
Purifique o vetor da moiety de acoplamento não redigido usando uma segunda etapa de ligação de cloreto de césio, conforme descrito no protocolo de texto. Perfure o tubo com uma agulha e aspire a banda vetorial em uma seringa. Transfira os vetores coletados para um tubo de 15 mililitros.
Se o combinado de ambos os tubos de gradiente for inferior a 2,5 mililitros, ajuste o volume para 2,5 mililitros adicionando tampão de anúncio. Carregue os virons combinados até uma coluna Pd igualmente atualizada e descarte o fluxo através. Em seguida, adicione três mililitros de tampão de anúncios à coluna e colete o fluxo através.
Adicione 333 microliters de glicerol ao fluxo coletado para obter a concentração final de 10%. Divida-os em alíquotas adequadas. Certificando-se de incluir uma alíquota de 20 microliters para uma determinação mais rigorosa pela medição de OD 260.
Armazene a solução vetorial a 80 graus Celsius até estar pronta para uso. Resultados representativos dos efeitos em 293 células indicam que a produção de vetores é bem sucedida. As células devem mostrar morfologia 40-48 horas depois de serem inoculadas com o vetor do vírus.
A phage SDS manchada de prata é então usada para avaliar a eficiência do acoplamento. Vetores com Cysteins introduzidos na base de pentonita capsomere, tanto com o hexônio modificado como não modificados são executados. As bandas Hexon exibem uma mudança indicando modificação bem sucedida de mais de 90% dos monômeros por capsídeo.
Ao tentar este procedimento, é importante garantir um ambiente de redução para partículas vetoriais não esfladas. Após a modificação, uma atmosfera regular é adequada. Cálculos documentais precisos têm que garantir a modificação quantitativa de todas as partículas vetoriais.
O desenvolvimento dessa técnica ajuda a pesquisar no campo da Terapia Genética para explorar ainda mais estratégias seguras e deficientes para a entrega de vetores. Após este procedimento, outros métodos como o acoplamento de ligantes para direcionamento ou corantes fluorescentes para rotulagem podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como uso de receptores e distribuição biológica. Por favor, certifique-se de obedecer suas normas locais de OGM e segurança de trabalho.
