이 방법은 유전자 치료, 종양 청약 및 유전 예방 접종 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 이해 하 고 adenovirus 유전자 전송 벡터의 상호 작용의 벡터 호스트의 이해를 촉진, 최신 임상 시험에서 가장 자주 사용 되는 벡터 유형. 이 기술의 주요 장점은 아데노바이러스 캡슐레이트는 선택된 위치에서 고도로 정의된 방식으로 구체적으로 변형될 수 있으며 간단한 화학을 사용하여 가변범위로 변형될 수 있다는 것입니다.
벡터 호스트 수정은 분석될 수 없고 또한 환자 지향적인 방법으로 변조되기 때문에 이 기술의 연루는 치료로 확장됩니다. 이 방법은 특정 벡터 호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하지만, 마우스와 같은 살아있는 유기체에서 바이러스 입자의 라벨링 및 추적에도 사용될 수 있습니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 두 분야에서 실용적인 지식을 필요로 바이러스학과 유기 화학의 독특한 조합으로 투쟁할 것이다.
이 기술의 특별한 데모는 여기에서 유기 화학의 방법이 세포 생물학 및 바이러스학의 방법을 충족하기 때문에 중요합니다, 필드 특정 처리 트릭을 포함. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 버퍼를 준비합니다. 각 그라데이션 버퍼의 1밀리리터의 무게를 측정하여 밀도를 확인합니다.
모든 버퍼를 살균한 후 TCEP의 산화를 방지하기 위해 TCEP를 아르곤 가스로 약 30초 간 스파지합니다. 유리병을 해동할 때 응축수가 쌓이는 것을 방지하기 위해 실리카 젤 구슬 쿠션으로 채워진 고체 분말 커플링 모에티를 함유한 바이알을 더 큰 튜브에 보관합니다. 이 튜브를 건조기에 넣습니다.
건조기의 공기를 제거하고 아르곤 가스로 대체하십시오. 그런 다음 각 튜브를 단단히 닫고 실리카 젤 구슬로 더 큰 용기로 옮습니다. 모든 튜브가 옮겨지면 용기를 닫습니다.
사용할 준비가 될 때까지 용기를 섭씨 80도에 보관하십시오. 해동할 준비가 되면 컨테이너를 실리카 구슬 레이어에 디시카에 넣습니다. 용기가 천천히 실온으로 따뜻하게 한 다음 용기를 열수 있습니다.
세포가 최적의 세포 병증에 도달하면 플레이트를 긁어 내고 상체관을 원심 분리 튜브로 이송하여 수집하십시오. 셀 서스펜션을 400회 G로 10분간 회전시. 다음으로, 10 밀리머 TCEP를 함유한 4밀리리터의 Ad 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 결과용액을 멸균 50 밀리리터 튜브로 이송한다.
액체 질소로 용액을 동결한 다음 섭씨 37도에서 수조에 녹입니다. 이 동결 해동 주기를 세 번 반복하여 벡터를 구출합니다. 원심분리기 는 5000G, 섭씨 4도에서 10분 동안.
원심 분리는 두 개의 울트라 원심분리기 튜브를 설정하여 두 개의 동일한 세슘 염화염화물 단계 그라데이션을 준비하기 시작했습니다. 이러한 각 튜브에 하부 위상의 3 밀리리터를 추가합니다. 상부 위상을 로드하기 전에 튜브의 하층 수준을 표시합니다.
그런 다음 상층의 5 밀리리터를 하부에 조심스럽게 쌓아 튜브 의 벽을 따라 매우 천천히 아래로 피펫을 합니다. 그라데이션이 준비되고 원심분리가 완료되면 두 그라데이션을 통해 샘플에서 상퍼를 동일하게 로드합니다. 각 그라데이션 튜브의 나머지 공간을 10밀리머 TCEP가 포함된 애드 버퍼로 채우면 튜브를 맨 위로 채우십시오.
반대 튜브의 무게를 0 중량 차이로 조정합니다. 원심분리기를 176000회 G, 섭씨 4도로 2시간 동안 변경합니다. 그 후 클램프를 사용하여 하나의 극원심분리관을 스탠드에 고정합니다.
액세스할 수 있는 낮은 위상 수준 주변영역을 떠나야 합니다. 거위 목램프를 튜브 위에 놓습니다. 마크 주위, 아래쪽과 상위 사이의 테두리에서, 뚜렷한 밴드를 볼 수 있어야합니다.
바늘로 튜브를 뚫고 벡터 밴드를 주사기로 흡인하여 벡터를 수집합니다. 수집된 벡터 비론을 15 밀리리터 튜브로 전송하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 커플링 기판의 양을 계산합니다. 그런 다음 벡터 용액을 적절한 크기의 튜브로 전송합니다.
그리고 결합 화합물 재고 용액의 계산 된 금액. 실온에서 1시간 동안 머리 위 회전으로 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 광고 버퍼를 추가하여 벡터 용액의 총 부피를 6밀리리터로 조정합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 제2 세슘 염화물 결합 단계를 사용하여 반응되지 않은 커플링 모에티로부터 벡터를 정화합니다. 바늘로 튜브를 뚫고 벡터 밴드를 주사기로 흡인시합니다. 수집된 벡터를 15 밀리리터 튜브로 전송합니다.
두 그라데이션 튜브에서 결합된 것이 2.5 밀리리터 미만인 경우 Ad 버퍼를 추가하여 볼륨을 2.5 밀리리터로 조정합니다. 결합된 비론을 동일한 업그레이드된 PD 열에 로드하고 흐름을 버립니다. 그런 다음 열에 광고 버퍼 3밀리리터를 추가하고 흐름을 수집합니다.
10%의 최종 농도를 얻기 위해 수집된 흐름에 글리세롤 333마이크로리터를 첨가합니다. 적절한 알리쿼트로 나눕니다. OD 260 측정을 통해 더 엄격한 측정을 위해 20 마이크로리터의 알리쿼트를 포함해야 합니다.
벡터 용액을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 80도에 저장합니다. 293세포에 미치는 영향의 대표적인 결과는 벡터 생산이 성공했음을 나타낸다. 세포는 바이러스 벡터로 접종된 후 40-48시간 후에 형태학을 보여줘야 한다.
실버 스테인드 SDS 파지는 커플링 효율을 평가하는 데 사용됩니다. 키스타인이 있는 벡터는 육각선이 수정되고 수정되지 않은 카포말레 펜톤 베이스에 도입된다. 헥슨 밴드는 캡시드 당 단량제의 90 % 이상을 성공적으로 수정하는 변화를 나타낸다.
이 절차를 시도하는 동안 unmodofied 벡터 입자에 대한 감소 환경을 보장하는 것이 중요합니다. 수정 후, 일반 분위기에 적합합니다. 정확한 다큐멘터리 계산은 모든 벡터 입자를 정량적 수정해야 합니다.
이 기술의 발달은 유전자 치료의 분야에서 연구를 통해 벡터 전달을 위한 안전하고 부족한 전략을 더 탐구하는 데 도움이 됩니다. 이 절차에 따라 라벨링을 위한 리간드의 결합 또는 형광염과 같은 다른 방법은 수용체 사용 및 바이오 분포와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 해당 지역의 GMO 및 작업 안전 규정을 준수해야 합니다.
