Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генной терапии, онколиза и генетической вакцинации. Это облегчает понимание и модуляцию векторных взаимодействий переносчиков аденовирусных генов, наиболее часто используемых векторных типов в клинических испытаниях в настоящее время. Основным преимуществом этого метода является то, что аденовирусные капсулы могут быть специально изменены в четко определенной манере на выбранных позициях и в переменной степени с помощью простой химии.
Последствия этого метода распространяется на терапию, потому что модификация векторного хозяина не только может быть проанализирована, но и модулировано ориентированным на пациента образом. Хотя этот метод дает представление о конкретных взаимодействиях хозяина вектора, он также может быть использован для маркировки и отслеживания вирусных частиц в живых организмах, таких как мыши. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться с уникальным сочетанием вирусологии и органической алхимии, которая требует практических знаний из обеих областей.
Специальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что здесь методы органической химии отвечают методам клеточной биологии и вирусологии, в том числе полевых трюков обработки. Для начала этой процедуры подготовят все буферы, изложенные в текстовом протоколе. Взвесь один миллилитр каждого градиентного буфера, чтобы проверить его плотность.
После стерилизации всех буферов, шпагге буферов, содержащих TCEP с аргонным газом в течение 30 секунд, чтобы предотвратить окисление TCEP. Храните флаконы, содержащие твердые порошкообразные соединения moiety в больших трубках, каждый из которых наполнен подушкой кремнезема гель бусы, чтобы предотвратить накопление конденсации воды при оттаивании флаконов. Поместите эти трубки в децикатор.
Удалите воздух в децикаторе и замените его аргоном. Затем плотно закройте каждую трубку и перенесите ее в большой контейнер с бусинками кремнеземного геля. После того, как все трубы были переданы, закройте контейнер.
Храните контейнер при 80 градусах Цельсия до готовности к использованию. Когда готовы к оттепели, поместите контейнер в слой бусинок кремнезема в desiccator. Дайте контейнеру медленно прогреться до комнатной температуры, а затем откройте контейнер.
Когда клетки достигают оптимального цитопатических влияет, собирать их путем соскабливания пластин и передачи супернатанта в центрифугу труб. Спин подвески ячейки на 400 раз G в течение 10 минут. Затем повторно приостанавливайте гранулы клеток в четырех миллилитров буфера Ad, содержащего 10 миллимолярный TCEP, и перенесите полученный раствор в стерильную 50-миллилитровую трубку.
Заморозить раствор в жидком азоте, а затем разморозить его на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Повторите этот цикл замораживания оттепели три раза, чтобы спасти вектор. Центрифуга при 5000 Г и четыре градуса по Цельсию в течение десяти минут.
В то время как центрифугирование излишало две ультра центрифуги трубы, чтобы начать подготовку двух равных градиентов шага хлорида цезия. Добавьте три миллилитров нижней фазы к каждой из этих трубок. Отметь уровень нижней фазы на трубе перед загрузкой верхней фазы.
Затем тщательно укладывают пять миллилитров верхней фазы к нижней фазе, трубя ее очень медленно вниз вдоль стенок трубки. Когда градиенты подготовлены и центрифуга является полной нагрузкой супернатант из образца в равной степени над двумя градиентами. Заполните оставшееся пространство в каждой градиентной трубке с Ad-буфер, содержащий десять миллимолярд TCEP убедившись, чтобы заполнить трубы вся дорогу до вершины.
Отрегулируйте вес противоположных труб до нулевой разницы в весе. И изменить центрифугу для 176000 раз G и 4 градусов по Цельсию в течение двух часов. После этого используйте зажим, чтобы зафиксировать одну ультра центрифугированную трубку до стенда.
Убедившись, чтобы оставить область вокруг нижнего уровня фазы отмечены доступными. Поместите гусиную лампу над трубкой. Вокруг знака, на границе между нижней и верхней фазами, должна быть видна отдельная полоса.
Проколите трубку иглой и аспирировать векторную полосу в шприц для сбора вектора. Перенесите собранные векторные вироны в 15 миллилитровую трубку и вычислите количество сотых субстратов, необходимых, как указано в текстовом протоколе. Затем перенесите векторное решение в трубку соответствующего размера.
И расчетное количество соединений соединения фондового раствора. Аккуратно смешайте накладным вращением в течение одного часа при комнатной температуре. Затем отрегулируйте общий объем векторного решения до шести миллилитров, добавив буфер рекламы.
Очистите вектор от неотредактированных мойети, используя второй шаг связывания хлорида цезия, как указано в текстовом протоколе. Проколите трубку иглой и аспирировать векторную полосу в шприц. Перенесите собранные векторы в 15 миллилитровую трубку.
Если комбинированный из обеих градиентных трубок составляет менее 2,5 миллилитров, отрегулируйте громкость до 2,5 миллилитров, добавив буфер рекламы. Загрузите комбинированные вироны к равному обновленному столбецу Pd и отбросьте поток. Затем добавьте в столбец три миллилитров буфера объявлений и соберите поток.
Добавьте 333 микролитров глицерола в собранный поток, чтобы получить окончательную концентрацию в десять процентов. Разделите их на подходящие алициты. Убедившись, чтобы включить aliquot 20 микролитров для более жесткого определения OD 260 измерения.
Храните векторный раствор при 80 градусах Цельсия до готовности к использованию. Репрезентативные результаты воздействия на 293 ячейки показывают, что векторное производство успешно. Клетки должны показать морфологию через 40-48 часов после прививки с переносчиком вируса.
Серебряный окрашенный фаг SDS затем используется для оценки эффективности соединения. Векторы с cysteins введенными в основу pentone капсомера оба с hexon доработанными и unmodified бегут. Группы Hexon демонстрируют сдвиг, указывающий на успешную модификацию более 90 процентов мономеров на капсид.
При попытке этой процедуры важно обеспечить сокращение среды для неизмененных частиц вектора. После модификации подходит обычная атмосфера. Точные документальные расчеты должны обеспечить количественную модификацию всех векторных частиц.
Разработка этого метода помогает исследованиям в области генной терапии для дальнейшего изучения безопасных и недостаточных стратегий для доставки переносчиков. После этой процедуры другие методы, такие как соединение лигандов для таргетинга или флуоресцентных красителей для маркировки могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как использование рецепторов и биораспределение. Пожалуйста, не забудьте соблюдать местные правила ГМО и безопасности труда.
