Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia genica, dell'oncolisi e della vaccinazione genetica. Facilita la comprensione e la modulazione delle interazioni vettoriali degli ospiti dei vettori di trasferimento genico adenovirus, il tipo vettoriale più frequentemente utilizzato negli studi clinici aggiornati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i capsulati di adenovirus possono essere specificamente modificati in modo altamente definito in posizioni selezionate e in misura variabile utilizzando una semplice chimica.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia perché la modifica dell'ospite vettoriale non può solo essere analizzata ma anche modulata in modo orientato al paziente. Sebbene questo metodo fornisca informazioni su specifiche interazioni vettoriali dell'ospite, può anche essere utilizzato per l'etichettatura e il tracciamento delle particelle virali negli organismi viventi, come i topi. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà con la combinazione unica di virologia e biochimica organica che richiede conoscenze pratiche da entrambi i campi.
La dimostrazione speciale di questa tecnica è fondamentale perché qui i metodi di Chimica Organica incontrano i metodi di Biologia Cellulare e Virologia, inclusi i trucchi di manipolazione specifici sul campo. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer come descritto nel protocollo di testo. Pesare un millilitro di ogni buffer di gradiente per controllarne la densità.
Dopo aver sterilizzato tutti i tamponi, sparge i tamponi contenenti TCEP con gas argon per circa 30 secondi per prevenire l'ossidazione del TCEP. Conservare le fiale contenenti la fossa di accoppiamento in polvere solida in tubi più grandi, ognuno riempito con un cuscino di perline in gel di silice, per evitare l'accumulo di acqua di condensazione durante lo scongelamento delle fiale. Mettere questi tubi in un essiccatore.
Rimuovere l'aria nell'essiccatore e sostituirla con gas argon. Quindi chiudere saldamente ogni tubo e trasferirlo in un contenitore più grande con perline in gel di silice. Una volta che tutti i tubi sono stati trasferiti, chiudere il contenitore.
Conservare il contenitore a 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Quando è pronto per scongelarsi, posizionare il contenitore in uno strato di perline di silice in un essiccatore. Lasciare riscaldare lentamente il contenitore a temperatura ambiente e quindi aprire il contenitore.
Quando le cellule raggiungono l'effetto citopatico ottimale, raccoglierle raschiando le piastre e trasferendo il supernatante in tubi di centrifuga. Ruotare la sospensione cellulare a 400 volte G per 10 minuti. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet cellulare in quattro millilitri di Ad buffer contenente TCEP da 10 millimolare e trasferire la soluzione risultante in un tubo sterile da 50 millilitri.
Congelare la soluzione in azoto liquido e quindi scongelarla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Ripeti questo ciclo di disgelo di congelamento tre volte per salvare il vettore. Centrifuga a 5000 G e quattro gradi Celsius per dieci minuti.
Durante la centrifugazione impostare due tubi ultra centrifuga per iniziare a preparare due gradienti uguali di passo cloruro di cesio. Aggiungere tre millilitri della fase inferiore a ciascuno di questi tubi. Contrassegnare il livello della fase inferiore sul tubo prima di caricare la fase superiore.
Quindi impilare con cura cinque millilitri della fase superiore fino alla fase inferiore, tubazione molto lentamente lungo le pareti del tubo. Quando i gradienti sono preparati e la centrifugazione è completa caricare il supernatante dal campione equamente sulle due sfumature. Riempire lo spazio rimanente in ogni tubo sfumato con Ad-buffer contenente dieci TCEP millimolare assicurandosi di riempire i tubi fino in cima.
Regolare il peso dei tubi opposti in base a una differenza di peso zero. E alterare la centrifuga per 176000 volte G e 4 gradi Celsius per due ore. Successivamente, utilizzare un morsetto per fissare un tubo di ultra centrifugazione a un supporto.
Assicurarsi di lasciare accessibile l'area intorno al livello della fase inferiore contrassegnata. Posizionare la lampada dal collo d'oca sopra il tubo. Intorno al segno, al confine tra le fasi inferiore e superiore, dovrebbe essere visibile una banda distinta.
Forare il tubo con un ago e aspirare la banda vettoriale in una siringa per raccogliere il vettore. Trasferire i viron vettoriali raccolti in un tubo da 15 millilitri e calcolare la quantità di substrato di accoppiamento necessaria come delineato nel protocollo di testo. Quindi, trasferire la soluzione vettoriale in un tubo di dimensioni appropriate.
E la quantità calcolata di composti di accoppiamento soluzione stock. Mescolare delicatamente con rotazione aerea per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, regola il volume totale della soluzione vettoriale in sei millilitri aggiungendo ad buffer.
Purificare il vettore dalla moietà di accoppiamento non transazionale usando un secondo passo di legame del cloruro di cesio come delineato nel protocollo di testo. Forare il tubo con un ago e aspirare la banda vettoriale in una siringa. Trasferire i vettori raccolti in un tubo da 15 millilitri.
Se la combinazione da entrambi i tubi gradiente è inferiore a 2,5 millilitri, regolare il volume a 2,5 millilitri aggiungendo ad buffer. Caricare i viron combinati su una colonna Pd aggiornata uguale ed eliminare il flusso. Quindi aggiungere tre millilitri di Buffer annuncio alla colonna e raccogliere il flusso attraverso.
Aggiungere 333 microlitri di glicerolo al flusso raccolto attraverso per ottenere la concentrazione finale del dieci per cento. Dividili in aliquote adatte. Assicurarsi di includere un'aliquota di 20 microlitri per una determinazione più rigorosa mediante misurazione OD 260.
Conservare la soluzione vettoriale a 80 gradi Celsius fino a quando non è pronta per l'uso. I risultati rappresentativi degli effetti su 293 cellule indicano che la produzione vettoriale ha successo. Le cellule devono mostrare morfologia 40-48 ore dopo essere state inoculate con il vettore virale.
Il fago SDS macchiato d'argento viene quindi utilizzato per valutare l'efficienza di accoppiamento. Vengono eseguiti vettori con Cistein introdotti nella base pentone capsomere sia con l'esagono modificato che non modificato. Le bande hexon mostrano uno spostamento che indica una modifica riuscita di oltre il 90% dei monomeri per capsid.
Durante il tentativo di questa procedura è importante garantire un ambiente riducente per particelle vettoriali non modificate. Dopo la modifica, è adatta un'atmosfera regolare. Precisi calcoli documentali devono garantire la modifica quantitativa di tutte le particelle vettoriali.
Lo sviluppo di questa tecnica aiuta la ricerca nel campo della terapia genica a esplorare ulteriormente strategie sicure e carenti per la consegna vettoriale. Seguendo questa procedura possono essere eseguiti altri metodi come l'accoppiamento di ligandi per il targeting o coloranti fluorescenti per l'etichettatura al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'uso del recettore e la bio distribuzione. Assicurati di rispettare le normative locali in materia di OGM e sicurezza sul lavoro.
